[发明专利]一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法及其应用

权利要求书

1.一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将荧光示踪物与一系列已知浓度的甘胆酸标准品溶液混合，再加入甘胆酸多克隆抗体溶液混合孵育进行竞争反应，测得该体系的荧光偏振值；将测得的荧光偏振值mP与空白组的荧光偏振值mP₀的比值即为抑制率，以抑制率mP/mP₀为纵坐标，已知甘胆酸标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线；y＝0.80675/[(1+(x/682.21468)^0.96872]+0.1536；

(2)将荧光示踪物与待测样品混合，再加入甘胆酸多克隆抗体溶液混合孵育进行竞争反应，测得该体系的荧光偏振值，再根据标准曲线，计算得到该待测样品中甘胆酸的浓度。

2.根据权利要求1所述的一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤(1)所述荧光示踪物为甘胆酸半抗原与荧光素的偶联物：

所述甘胆酸半抗原是由胆酸与4-氨基丁酸反应生成的N-(3,7,12-三羟基-24-羰基胆烷-24-基)-丁氨酸作为甘胆酸半抗原；

所述荧光素为异硫氰酸荧光素乙二胺。

3.根据权利要求1所述的一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤(1)所述甘胆酸多克隆抗体的具体制备过程是按照申请号为201610727381.2的中国专利申请中所记载的步骤进行制备的。

4.根据权利要求1所述的一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤(1)所述一系列已知浓度的甘胆酸标准品溶液的溶质为甘胆酸标准品，溶剂为磷酸盐缓冲溶液；

所述磷酸盐缓冲溶液中，NaH₂PO₄·2H₂O的摩尔质量为1-8mmol/L，Na₂HPO₄·12H₂O的摩尔质量为8-15mmol/L，氯化钠的摩尔质量为10-20mmol/L，pH值为7.0-8.5；

所述一系列已知浓度为10⁶ng/mL，10⁵ng/mL，10⁴ng/mL，10³ng/mL，100ng/mL，10ng/mL和1ng/mL共7个梯度浓度。

5.根据权利要求1所述的一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤(1)所述荧光示踪物的工作浓度是以10-15倍空白溶液的偏振光强度作为其工作浓度，空白溶液选用硼酸盐缓冲液；

所述硼酸盐缓冲溶液中，硼酸钠的摩尔质量为4-30mmol/L，氯化钠的摩尔质量为1-10mmol/L，pH值为7.0-9.0。

6.根据权利要求1所述的一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤(1)所述甘胆酸多克隆抗体的稀释度为1:1000-1:3000。

7.根据权利要求1所述的一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤(1)所述加入荧光示踪物的体积，甘胆酸标准品溶液的体积，甘胆酸多克隆抗体溶液的体积分别为400-500μL，10-50μL，400-500μL；所述孵育时间为1-8min，竞争反应温度为20-30℃。

8.根据权利要求1所述的一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤(2)所述加入荧光示踪物的体积，待测样品的体积，甘胆酸多克隆抗体溶液的体积分别为400-500μL，10-50μL，400-500μL；所述孵育时间为1-8min，竞争反应温度为20-30℃。

9.根据权利要求1所述的一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法，其特征在于：步骤(2)所述待测样品为人血清。

10.根据权利要求1所述的一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法在检测肝炎患者血清和健康人血清中的应用。