[发明专利]一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫分析技术检测领域，具体涉及一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法及其应用。

背景技术

甘胆酸是由胆酸和甘氨酸结合而成的结合型胆酸，是胆汁酸的主要成分之一。在肝细胞内，胆固醇经过极其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸，包含胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)，胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12)，侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合成为甘胆酸，分子量为466.3。甘胆酸由肝细胞合成后，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物中脂肪的消化吸收。大部分胆汁酸在回肠和结肠被重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用，重吸收的甘胆酸又进入肝-肠循环，通过这种机制，机体能充分利用甘胆酸。在正常情况下，外周血中甘胆酸含量甚微，正常人无论空腹或餐后，其甘胆酸浓度都稳定在低水平。当人体肝细胞受损或胆汁淤滞时，就会引起甘胆酸代谢和循环紊乱，使肝细胞摄取甘胆酸的能力下降，导致血液中甘胆酸含量升高，且甘胆酸含量的高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关。有实验数据显示急性肝炎、原发性肝癌、肝硬化等患者血清中甘胆酸含量均明显高于正常人，且呈递性增高。甘胆酸含量还是反映多种胆道系统疾病、孕妇妊娠期肝内胆汁淤积症、酒精性肝损害等的重要指标。因此，甘胆酸检测作为一项重要的临床检验项目，可为多种疾病的临床诊断、治疗、疗效评价以及预后评估提供重要依据，应用和推广前景巨大。

目前关于甘胆酸的检测方法主要是仪器方法，如高效液相-串联质谱法以及超高效液相色谱质谱方法，这些方法需要大型仪器和复杂的样品前处理；另一方面是免疫法，主要包括放射免疫法(RIA)、化学发光免疫法及免疫透射比浊法。虽然这些方法准确度高、重复性好，适用于定量检测等优点，但是这些检测技术操作复杂，大多是非均相的反应体系，需要多次孵育和洗涤，耗时长、成本高，不能满足高通量快速检测的要求；仪器设备价格昂贵、操作步骤流程多、耗时长等缺点，不利于常规实验室开展，临床应用局限性明显。

免疫荧光技术是用化学方法使荧光素标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的相应抗原(或抗体)结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。该方法具有高特异性、灵敏性、便捷等优点，被广泛的运用在小分子检测领域。

荧光偏振免疫分析方法(FPIA)是一种简单、快速、高效和可靠的分析技术，体系完全在均相溶液内完成反应，不需要分离和洗涤操作，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、成本低廉、易于自动化的高通量筛选等优点，逐渐成为临床，食品和环境等领域中小分子检测分析的常用技术。而且，血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法还未见报道，具有广阔的开发价值。

发明内容

为了克服现有技术中甘胆酸免疫检测技术，操作复杂、耗时长的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法。该方法整个检测过程只需要一步竞争反应，操作简单，高效简便。

本发明的目的在于提供一种上述检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测血清中甘胆酸的荧光偏振免疫分析方法，包括以下步骤：

(1)将荧光示踪物与一系列已知浓度的甘胆酸标准品溶液混合，再加入甘胆酸多克隆抗体溶液混合孵育进行竞争反应，测得该体系的荧光偏振值；将测得的荧光偏振值mP与空白组的荧光偏振值mP₀的比值即为抑制率，以抑制率mP/mP₀为纵坐标，已知甘胆酸标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线：y＝0.80675/[(1+(x/682.21468)^0.96872]+0.1536；

(2)将荧光示踪物与待测样品混合，再加入甘胆酸多克隆抗体溶液混合孵育进行竞争反应，测得该体系的荧光偏振值，再根据标准曲线，计算得到该待测样品中甘胆酸的浓度。

步骤(1)所述荧光示踪物为甘胆酸半抗原与荧光素的偶联物：

所述甘胆酸半抗原是由胆酸与4-氨基丁酸反应生成的N-(3,7,12-三羟基-24-羰基胆烷-24-基)-丁氨酸作为甘胆酸半抗原；

所述荧光素为异硫氰酸荧光素乙二胺(EDF)。

步骤(1)所述甘胆酸多克隆抗体的具体制备过程是按照申请号为201610727381.2的中国专利申请中所记载的步骤进行制备的。

步骤(1)所述一系列已知浓度的甘胆酸标准品溶液的溶质为甘胆酸标准品，溶剂为磷酸盐缓冲溶液；