[发明专利]一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法

权利要求书

1.一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法，其特征在于，基于GC-MS技术对含杀菌剂和无药对照培养基上培养的病原菌菌丝进行代谢组检测，通过比较代谢组学研究法寻找差异代谢物，排除不同作用机制共有的代谢物，获得目标杀菌剂作用机制的特异性生物标志物，利用生物标志物含量的变化来实现对杀菌剂作用机制的识别及高通量分析；

其中，所述病原菌包括病原真菌和病原卵菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、菌丝培养、收集、灭活和保存；

S2、代谢组样品前处理和GC-MS检测；

S3、利用比较代谢组寻找生物标志物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1具体如下：

将病原菌的菌丝于固体培养基上于18～37℃培养～1～7d，菌落外缘沿同心圆打取菌饼，接至铺有玻璃纸的含有抑制菌丝生长20％～80％浓度杀菌剂的培养基平板上，对照组添加等量有机溶剂；用刮刀刮取玻璃纸上的菌丝培养物，去除接种的菌饼，收集至离心管中；将装有菌丝的离心管置于液氮中速冻3～5min灭活，获得的菌丝样品置于-80℃冰箱保存；

其中，所述固体培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂PDA、V8A、酵母葡萄糖琼脂YGA、胡萝卜琼脂CA或燕麦粉琼脂培养基OA；

所述有机溶剂选自二甲基亚砜、甲醇、丙酮中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2具体如下：

S21、冷冻干燥及研磨破碎：灭活后的菌丝冷冻干燥后研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理，得菌丝粉末；

S22、代谢物提取：称取30.0±0.2mg的菌丝粉末，加入1.8mL溶解0.1～100μg/mL内标物质的提取溶剂，采用涡旋振荡1min后，继续超声提取20min；

S23、离心干燥：将步骤S22中提取获得的代谢物溶液在4000～12000r/min下离心5～15min，弃去沉淀，得代谢物提取液；取0.6mL代谢物提取液至0.6mL离心管中，45℃抽真空离心干燥4～8h，直至质量恒定；

S24、衍生化：包括肟化或腙化以及三甲基硅烷化两步衍生化反应；

S25、GC-MS检测：采用HP-5MS毛细管柱，规格30m×0.25mm×0.25μm；进样体积1μL；流速1mL/min；程序升温；离子源温度为230～300℃，传输线温度为230～300℃；氦气为载气，恒流模式；采用EI电离源，全扫描扫描范围m/z 20～650，频率0.2s/scan；溶剂延迟时间5.9min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S22中所述提取溶剂为甲醇和水混合溶液，甲醇与水的体积比为9.5:0.5-5:5；所述内标物质为水杨苷。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S24衍生化的操作步骤如下：

1)取100μL衍生化试剂1加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声20min，涡旋1min溶解，稍微离心后30℃条件下进行肟化或腙化衍生化反应2h；

2)加入100μL的衍生化试剂2至样品管中，封口，超声20min，涡旋1min溶解，稍微离心，37℃条件下进行硅烷化衍生反应4～10h；

3)衍生化获得的样品在转速10000～15000r/min下离心15min，吸取上清液至GC样品玻璃管中，获得用于GC-MS检测的病原菌菌丝代谢物样品；

其中，步骤1)所述衍生化试剂1为甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得的溶液，浓度为10～40mg/mL；步骤2)所述衍生化试剂2选自三甲基氯硅烷、N,O-双三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，O-双三甲硅基三氟乙酰胺、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N-甲基-N-三甲硅基乙酰胺中的至少一种。