[发明专利]一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法

说明书

技术领域

本发明涉及杀菌剂药理学和代谢组分析技术领域，具体地说，涉及一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法。

背景技术

杀菌剂在农业生产中是保障农作物免受病害损失的重要生产资料，随着病菌对常用杀菌剂抗性的产生以及人们对食品安全、生态健康的关注，要求研究人员不断寻找新的生物靶标蛋白和新型活性结构的化合物，从而发现了大批新型的低毒、高效、低残留的具有抑菌活性化合物，为田间病害的有效控制提供了优秀杀菌剂潜在资源。但是，一个药剂的成功开发，不仅需要关注其生物活性，研发者更需要关注化合物对有害生物的作用机制，以避免新化合物与已有商品化农药品种因作用机制类似带来的高抗药性风险。

杀菌剂作用机制研究难度较大，目前尚缺少快速研究方法。通常采用常规生物学方法如测定杀菌剂对病原菌不同发育阶段的抑菌效果、生化测定法、药剂与靶标蛋白对接预测、亲和层析的方法从组蛋白中筛选出可以与药剂相结合的蛋白等方法，也有研究通过交互抗性来预判化合物与已有药剂的相似性。这些方法通常研究难度较大，耗时较长。近年来随着组学技术的发展，人们开始尝试从蛋白组和转录组等角度尝试解析新化合物的作用机制，并获得了较好的结果。而代谢组学方法以其快速、可靠、信息挖掘能力强等特点在农药作用机制研究中受到越来越多的关注。

代谢组学是在特定条件下对生物系统大量代谢物的全面定性和定量分析。代谢组学研究主要包括代谢指纹分析、代谢轮廓分析和代谢组分析这3个层次。代谢指纹分析对不同处理下生物系统的代谢指纹进行模式判别分析。目前模式判别的方法主要有主成分分析PCA、层次聚类分析HCA、神经网络分析ANN及热图Heatmap等。模式判别可以表明不同处理下生物系统代谢组指纹异同，进而判定处理因素的异同。代谢轮廓分析可以表明特定处理下靶标生物系统特定代谢途径或特定类别的代谢物的量上的变化，即特定处理因素引起靶标生物系统代谢轮廓的变化。代谢组分析是指特定条件下对靶标生物系统所有的代谢物进行定性和定量分析，广泛应用于非靶标代谢研究中。

当前代谢组学已成为农药作用机制研究的强大工具。代谢组学通过农药作用下靶标生物代谢指纹变化规律与药剂作用机制相联系来推定新化合物作用机制，应用于除草剂、杀虫剂和杀菌剂作用机制的区组已有部分报道。通过代谢轮廓分析可以探明生物体系(细胞，组织或生物体)受外部刺激所发生调整的代谢标志物，但采用生物标志物的方法快速识别杀菌剂作用机制目前尚未见报道。

通过比较代谢组学研究，分析杀菌剂作用下病原菌代谢轮廓的差异，并获得与药剂作用机制密切相关的生物标志物，从而利用生物标志物进行活性化合物作用机制的快速识别，成为解决目前杀菌剂作用机制研究中存在的缺少快速识别方法问题的有效手段。但目前有关杀菌剂作用机制生物标志物及其研究方法国内外鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于代谢组学法寻找杀菌剂作用机制生物标志物和利用生物标志物快速识别活性物质作用机制的方法。

本发明的另一目的是提供琥珀酸脱氢酶抑制剂Succinate dehydrogenase inhibitors(SDHIs)的作用机制生物标志物。

为了实现本发明目的，本发明提供一种基于代谢组学的杀菌剂作用机制研究方法，基于GC-MS技术对含杀菌剂和无药对照培养基上培养的病原菌(包括病原真菌和病原卵菌)菌丝进行代谢组检测，通过比较代谢组学研究法寻找差异代谢物，排除不同作用机制共有的代谢物，获得目标杀菌剂作用机制的特异性生物标志物，利用生物标志物含量的变化来实现对杀菌剂作用机制的识别及高通量分析。

所述方法包括以下步骤：

S1、菌丝培养、收集、灭活和保存；

S2、代谢组样品前处理和GC-MS检测；

S3、利用比较代谢组寻找生物标志物。

所述菌丝培养、收集、灭活和保存方法为：将病原菌的菌丝于固体培养基(例如马铃薯葡萄糖琼脂PDA、V8A、酵母葡萄糖琼脂YGA、胡萝卜琼脂CA或燕麦粉琼脂培养基OA等，根据病原菌选择合适的培养基)上于18～37℃培养1～7d，菌落外缘沿同心圆打取菌饼，接至铺有玻璃纸的含有抑制菌丝生长20％～80％浓度杀菌剂的培养基平板上，对照组添加等量有机溶剂。用刮刀刮取玻璃纸上的菌丝培养物，去除接种的菌饼，收集至离心管中。将装有菌丝的离心管置于液氮中速冻3～5min灭活，获得的菌丝样品置于超低温(优选-80℃)冰箱保存。

其中，所述有机溶剂选自二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、丙酮中的至少一种。

所述代谢组样品前处理和GC-MS检测方法为：