[发明专利]一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法

权利要求书

1.一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1、制备类胡萝卜素粗提物：准确称取10g法夫酵母菌体，加入200mL的6mol/L乳酸溶液，30℃破壁10min，破壁后4500rpm离心10min，去除粘稠的乳酸溶液，量取200mL蒸馏水加入剩余的菌体中，搅拌均匀，4500rpm离心10min，去除上层蒸馏水，反复水洗3次，保留菌体于杯底，加入200mL丙酮溶液，常温浸提5min，4500rpm离心10min，收集上清液，旋转蒸发后即得到类胡萝卜素粗提物；

S2、配置HSCCC溶剂体系：按照正己烷：丙酮：乙醇：水的体积比为1.2:1:1:0.8的比例量取各溶剂于分液漏斗中，并在15-25℃下充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声20min，以上相作为HSCCC的流动相，下相作为HSCCC的固定相；

S3、洗脱：以上相作为HSCCC的流动相，下相作为HSCCC的固定相，采用正向模式，即从尾到头进行洗脱，首先将下相溶液固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，将转数调至350-850rpm后，以1-15mL/min的流速将上相溶液流动相泵入色谱柱中；

S4、进样：待主机螺旋管内流动相与固定相达到动力学平衡，即检测器端口只有流动相被置换出时，可准备进样，样品从进样环注入管路的同时点下色谱工作站中的记录按钮，紫外检测波长设置为474nm，根据紫外吸收色谱图手动收集各馏分；

S5、硅胶柱层析分离：将HSCCC分离得到的各个组分用正相硅胶柱层析进一步分离，将硅胶置于80℃烘箱活化2h，称取22.1g活化的200-300目的硅胶于烧杯中，加入100mL石油醚搅拌均匀，湿法装柱，柱子规格为35×1.5cm的玻璃柱，待硅胶自然沉降，石油醚平衡至柱体积不再变化，最后装填高度为25.1cm，将样品溶于少量的二氯甲烷，湿法上样，用不同比例的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，按条带收集组分；

S6、组分鉴定：将步骤S4收集到的组分按顺序编号，以海胆酮标准品作为对照，利用高效液相色谱、质谱的方法进行鉴定，通过分析各编号样品与海胆酮的质谱图，即可确定某一编号对应的组分为海胆酮。

2.根据权利要求1所述的一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法，其特征在于：步骤S2中所述的充分震荡的温度优选25℃。

3.根据权利要求1所述的一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法，其特征在于：步骤S3中所述的流动相的流速优选3mL/min。

4.根据权利要求1所述的一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法，其特征在于：步骤S3中所述的转数优选850rpm。

5.根据权利要求1所述的一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法，其特征在于：步骤S4中所述的进样，其样品的浓度为20mg/mL，样品的量为10mL。

6.根据权利要求1所述的一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法，其特征在于：步骤S5中所述的用不同比例的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，其洗脱条件为：按体积分比：100％石油醚200mL，98％石油醚+2％丙酮200mL，95％石油醚+5％丙酮400mL，92％石油醚+8％丙酮100mL，85％石油醚+15％丙酮100mL，80％石油醚+20％丙酮300mL。