[发明专利]一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法

说明书

本发明公开了一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法,先通过乳酸破壁、丙酮粗提的方法从法夫酵母中得到类胡萝卜素粗提物，再利用HSCCC‑硅胶柱层析联合的方法进一步分离纯化，最后通过高效液相色谱、质谱的方法鉴定得到海胆酮，从而实现从法夫酵母中直接分离纯化出天然的海胆酮的目的，所得到的海胆酮纯度高、杂质少。

技术领域

本发明涉及分离提纯技术领域，具体涉及一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法。

背景技术

法夫酵母作为类胡萝卜素主要的微生物来源，它能大量积累类胡萝卜素，其中虾青素的含量占到类胡萝卜素总含量的90%以上，其他类胡萝卜素仅占10%左右，例如海胆酮、海胆酮、玉米黄质、番茄红素、角黄素、β-隐黄质等。大量文献报道，这些类胡萝卜素具有较好的生物活性，例如抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗癌、预防心血管疾病、提高免疫活性等。

尤其海胆酮经常作为天然的色素，除了具有抗氧化活性外，还具有前维生素A的活性。因此解决海胆酮的分离纯化是一个尤为重要的问题，目前常用的分离纯化方法是柱层析法，但是由于样品的吸附性大、极性相似不易分离等问题，所以寻找一个新的分离纯化方法是十分有必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法。

本发明采用以下技术方案：

一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法：包括如下步骤：

S1、制备类胡萝卜素粗提物：准确称取10 g法夫酵母菌体，加入200 mL的6 mol/L乳酸溶液，30 ℃破壁10 min，破壁后4500 rpm离心10 min，去除粘稠的乳酸溶液，量取200mL蒸馏水加入剩余的菌体中，搅拌均匀，4500 rpm离心10 min，去除上层蒸馏水，反复水洗3次，保留菌体于杯底，加入200 mL丙酮溶液，常温浸提5 min，4500 rpm离心10 min，收集上清液，旋转蒸发后即得到类胡萝卜素粗提物；

S2、配置HSCCC（高速逆流色谱）溶剂体系：按照正己烷：丙酮：乙醇：水的体积比为1.2:1:1:0.8的比例量取各溶剂于分液漏斗中，并在15-25℃下充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声20 min，以上相作为HSCCC的流动相，下相作为HSCCC的固定相；

S3、洗脱：以上相作为HSCCC的流动相，下相作为HSCCC的固定相，采用正向模式，即从尾到头进行洗脱，首先将下相溶液（固定相）以30 mL/min的流速泵满色谱柱，将转数调至350-850rpm后，以1-15mL/min的流速将上相溶液（流动相）泵入色谱柱中；

S4、进样：待主机螺旋管内流动相与固定相达到动力学平衡，即检测器端口只有流动相被置换出时，可准备进样，样品从进样环注入管路的同时点下色谱工作站中的记录按钮，紫外检测波长设置为474 nm，根据紫外吸收色谱图手动收集各馏分；

S5、硅胶柱层析分离：将HSCCC分离得到的各个组分用正相硅胶柱层析进一步分离，将硅胶置于80℃烘箱活化2 h，称取22.1 g活化的200-300目的硅胶于烧杯中，加入100mL石油醚搅拌均匀，湿法装柱，柱子规格为35×1.5 cm的玻璃柱，待硅胶自然沉降，石油醚平衡至柱体积不再变化，最后装填高度为25.1 cm，将样品溶于少量的二氯甲烷，湿法上样，用不同比例的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，按条带收集组分；

S6、组分鉴定：将步骤S4收集到的组分按顺序编号，以海胆酮标准品作为对照，利用高效液相色谱、质谱的方法进行鉴定，通过分析各编号样品与海胆酮的质谱图，即可确定某一编号对应的组分为海胆酮。

进一步地，步骤S2中所述的充分震荡的温度优选25℃。

进一步地，步骤S3中所述的固定相的流速优选3mL/min。