[发明专利]一种柞蚕微孢子虫模板DNA的提取方法及其在分子诊断方面的应用

说明书

本发明公开一种快速提取柞蚕微孢子虫模板DNA的方法及其应用，具体的所述模板提取的方法为，应用碱裂解结合磁珠进行DNA的释放、富集、分离与纯化，该方法操作简单快速、成本低、通量高、能活蛹取样、抗干扰能力强、污染风险低，提取的DNA品质高、可自动化，可以广泛应用于分子学诊断中，能显著提高检测通量、操作便利性，并显著降低检测假阳性率，提高检测灵敏度、准确度和检测效率；通过串联核酸自动提取仪和PCR仪、优选结果可视的PCR技术，能实现在多孔板上进行集批量DNA提取与分子诊断于一体的柞蚕微孢子虫可视化、自动化诊断技术。对柞蚕产业集中检疫柞蚕微粒子病和种质资源保护具有重要意义。

技术领域

本发明属于病原微生物的DNA提取方法及应用技术领域，具体涉及一种快速获取柞蚕微孢子虫模板DNA的方法及其在分子诊断方面的应用。

背景技术

柞蚕（Antheraea pernyi）起源于中国，是人类最宝贵的生物资源之一。我国是世界柞蚕业第一大国，产茧量占世界总产茧量的90%。目前我国柞蚕茧年产量8万吨以上，直接产值25亿元，蚕茧加工及综合利用产值180多亿元。柞蚕业已成为我国山区农村难以替代的主导优势产业。然而，自柞蚕产业形成规模之后，柞蚕微粒子病一直困扰着柞蚕业的发展，该病害的主要特点是危害时间长，资源浪费严重，分布广泛，传染途径复杂，该病害一旦爆发会造成重大经济损失，因此被列为柞蚕生产上重要的检疫性病害。

柞蚕微粒子病是由柞蚕微孢子虫（Nosema pernyi, Np）寄生柞蚕所引起，主要通过胚种和食下进行传染。由于柞蚕野外放养的产业特点，杜绝胚种传播成为防治微粒子病的主要途径。

目前，生产上普遍使用光学显微镜检查法（镜检，Microscopy）在制种过程中对雌蛾进行筛查，通过淘汰病蛾及其卵来切断微孢子虫的传播。该法简单易学、实用性强。但该法对制种人员的经验依赖性较高，检测结果的灵敏度和准确性差异较大。而且，微孢子虫的发育大致可分为孢原质期(Sporoplasmodium)、裂殖期(Merogony)、产孢期(Sporogony)以及成熟孢子期(Spore)四个阶段，而镜检主要针对成熟的微孢子虫，必然会存在漏检的情况，对于有效控制微粒子病害的作用有限。同时，镜检费时、费力，易诱发检测人员眼部疾病。

在现有技术中，王伯阳等人公开了一种利用柞蚕微孢子虫孢子液直接免疫家兔获得柞蚕微孢子虫多克隆抗体的方法，建立了胶体金免疫层析检测法，但是该法灵敏度偏低，当柞蚕微孢子虫浓度低于8000个/μL时，该检测试纸条显色较浅或不显色，结果不稳定，无法进行准确判定。随后，姜义仁等人建立了柞蚕微孢子虫间接竞争酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法，将检测灵敏度提高到160个/μL，但其操作非常繁琐，配合生产难度大。