[发明专利]一种用于PCSK9蛋白检测的电化学免疫传感器制备方法

权利要求书

1.一种用于PCSK9蛋白检测的电化学免疫传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)氨基化富勒烯-钯铂纳米粒子(n-C₆₀/PdPt)复合材料的制备；

(2)铂纳米粒子-聚亚甲蓝(Pt-PMB)-Ab₂纳米信标的制备；

(3)建立免疫传感器，测定PCSK9蛋白，绘制标准曲线。

2.根据权利要求1所述n-C₆₀/PdPt纳米复合材料的制备过程具体包括以下步骤：

首先，将2mg氨基化富勒烯(n-C₆₀)溶解在2mL 0.1M的盐酸(HCl)中，在室温下超声2小时，得到均匀的悬浮液。然后将溶液搅拌加热至100℃，分别加入1mL 4mM氯钯酸钠(Na₂PdCl₄)，1mL 4mM四氯铂酸钾(K₂PtCl₄)和150mg抗坏血酸(AA)，并在100℃下连续搅拌2.5小时。自然冷却至室温后，将得到的产物离心，用超纯水洗涤3次。将最终的沉淀物分散在1mL超纯水中进一步使用。

3.根据权利要求1所述Pt-PMB-Ab₂纳米信标的制备过程具体包括以下步骤：

(1)Pt-PMB纳米复合材料的制备：

首先，室温下将2mL 4.9mM亚甲蓝(MB)，3mL 2.28mM十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)和600μL0.1M HCl在剧烈搅拌混合10分钟后形成胶束。然后将160μL 5％氯铂酸(H₂PtCl₆·6H₂O)快速加入胶束中，并在室温下持续搅拌6小时。最后将得到的复合物离心和洗涤3次后，分散在2mL超纯水中供下一步使用。

(2)Pt-PMB-Ab₂纳米信标的制备：

将所制备的1mL Pt-PMB与100μL 1mg mL^-1 PCSK9抗体混合，并在4℃下轻轻搅拌12小时。然后，加入1％牛血清白蛋白(BSA)阻断非特异性结合位点。最后，将所得的Pt-PMB-Ab₂生物共轭物，用磷酸缓冲液PBS(0.1M，pH7.4)离心洗涤3次，分散在1mL PBS(0.1M，pH7.4)溶液中并在4℃中储存。

4.根据权利要求1所述的建立电化学免疫传感器，测定PCSK9蛋白，绘制标准曲线，其特征在于包括以下步骤：

(1)分别用0.3和0.05μm的Al₂O₃粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

(2)将10μL 0.4mg mL^-1电极修饰材料氮掺杂的石墨烯纳米带(N-GNRs)滴加在电极表面，室温干燥。

(3)将8μL n-C₆₀-PdPt纳米复合材料修饰到干燥的电极表面，室温干燥。

(4)将修饰好的电极滴加6μL 0.1mg mL^-1的金环色葡萄球菌A蛋白(SPA)，在37℃孵育40min。

(5)用超纯水将孵育后的电极冲洗干净后滴加8μL PCSK9抗体，在37℃孵育60min。

(6)用超纯水将孵育后的电极冲洗干净后滴加6μL，1％的BSA溶液室温孵育30min。

(7)将上述BSA封闭后的电极用清洗缓冲液(10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，37mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)冲洗干净并在氮气中干燥。

(8)将不同浓度的目标PCSK9滴加在电极上并置于37°孵育60min。

(9)在干燥后的电极上滴加8μL Pt-PMB-Ab₂纳米信标并置于37℃孵育60min。

(10)将孵育后的电极用清洗缓冲液冲洗干净后置于氮气中干燥。

(11)将电极置于5mL，0.1M PBS(0.1M Na₂HPO₄，0.1M KH₂PO₄，0.1M KCl)中进行表征，测量差示脉冲伏安电流值。

(12)根据所得电流变化值与PCSK9蛋白浓度呈线性关系，绘制工作曲线。