[发明专利]一种用于PCSK9蛋白检测的电化学免疫传感器制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及可用于预测和诊断心血管病的生物标志物即前蛋白转化酶枯草溶菌素Kexin 9型(PCSK9)检测的电化学免疫传感器的制备方法及应用，基于氮掺杂石墨烯纳米带(N-GNRs)，氨基化富勒烯-钯铂纳米粒子(n-C₆₀/PdPt)作为电极修饰材料，铂纳米粒子-聚亚甲蓝(Pt-PMB)作为纳米信标制备的夹心型免疫传感器，用于检测PCSK9，属于电化学检测领域。

背景技术：

目前，心血管疾病因其发病率、致残率和致死率较高，威胁人类的健康，严重影响人们生活质量，已经成为导致人类死亡的主要原因。前蛋白转化酶枯草溶菌素Kexin 9型(PCSK9)是一种主要由肝脏合成的分泌型丝氨酸蛋白酶，属于前蛋白转化酶家族。与低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，使肝细胞表面LDLR减少，进而使肝细胞对LDL-C颗粒清除能力下降，血浆LDL-C水平升高，导致动脉粥样硬化的发生和发展，促进心脑血管事件的发生。有研究表明，人血清中的PCSK9是可用于心血管病诊断与预测其发病风险的一个可靠而良好的生化标志物。因此，定量检测人血清中PCSK9对心血管病的发生有十分重要的意义。

虽然用于PCSK9的传统检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光免疫法等方法，但这些方法存在许多不足，如样品处理过程过于繁琐、分析时间较长、灵敏度有限等。近年来，电化学免疫传感器技术作为新兴的检测技术，具有快速、灵敏度高、操作简单、稳定性好等特点，并且已广泛应用于生化分析、环境监测、临床研究和食品质量检测等领域，这种方法对PCSK9的检测提供了新的研究思路。

在电化学免疫传感器分析技术中，为了提高检测的灵敏度和缩短响应时间，满足临床上痕量物质的定量快速检测，目前多采用“三明治”型的传感器反应模式。其原理是基于构建负载一抗(Ab₁)-被测目标Ab-标记纳米信标(Ab₂)夹心免疫复合物的分析方法。如何简便、快速的实现对目标物质进行检测是将其推广应用的重要标准。为实现这一目的，电极修饰材料和纳米信标的选择显得尤为重要。近年来，在碳纳米材料中，N-GNRs作为新型的碳材料，具有良好的导电性和优良的物理化学性能，在电化学生物传感技术中广泛应用。基于以上优点，本实验采用N-GNRs作为电极修饰材料增加导电性。为了增加传感器的灵敏度，本实验引入了钯铂纳米粒子(PdPt)，由于其具有良好的导电性、较大的比表面积、良好的生物相容性等特点，可以放大电化学免疫传感器电信号，同时为了增加PdPt的固载量，采用了比表面积大的n-C₆₀结合PdPt形成n-C₆₀/PdPt纳米复合材料来固载更多的蛋白。此外，抗体在电极上的固定是构建免疫传感器的重要步骤，因此本课题采用葡萄球菌蛋白A(SPA)，它是金黄色葡萄球菌的细胞壁组分，具有四个活性位点，其具有特异性结合免疫球蛋白G(IgG)的非抗原性Fc部分并且使抗原结合位点游离。因此，抗体可以通过SPA定向结合在在电极表面上，并克服了抗体的随机取向和空间位阻的问题，并大大减少捕获抗体的时间。同时，本课题拟采用首次合成的氧化还原探针Pt-PMB作为纳米信标，由于其具有均匀的形态、强的氧化还原性和良好的导电性，可以克服传统的电聚合亚甲蓝形态不均一、易与生物分子脱离的缺点。而且因为有PtNPs的存在，增加了纳米信标的稳定性，也可以与抗体通过金属-氨基配位结合，通过抗原抗体特异性结合实现夹心型免疫传感器的构建。

该项目建立了一个简单、快速的检测方法实现了对PCSK9的特异、超灵敏检测。为临床的心血管病预测和诊断提供相应的参考。

发明内容：

1.本发明的目的是提供一种用于PCSK9蛋白的电化学免疫传感器的制备方法与应用，其特征包括以下步骤：

(1)氨基化富勒烯-钯铂纳米粒子(n-C₆₀/PdPt)复合材料的制备；

(2)铂纳米粒子-聚亚甲蓝(Pt-PMB)-Ab₂纳米信标的制备；

(3)建立免疫传感器，测定PCSK9蛋白，绘制标准曲线。

2.本发明所述n-C₆₀/PdPt纳米复合材料的制备过程具体包括以下步骤：