[发明专利]一种用于CYP2C19*2检测的电化学传感器

说明书

技术领域：

本发明涉及一种在临床上定量诊断CYP2C19*2等位基因检测的电化学传感器的制备方法及应用，尤其是基于富勒烯纳米复合材料作为信号探针制备的夹心型生物传感器，用于检测CYP2C19*2等位基因，属于电化学检测领域。

背景技术：

氯吡格雷是目前应用最为广泛的抗栓药物之一，可用于治疗动脉粥样硬化性心脑血管疾病包括缺血性脑卒中、心肌梗死和周围动脉疾病，是急性冠脉综合征(ACS)和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后预防缺血性事件发生、改善临床预后的常规药物。氯吡格雷作为一种前体药物，需经细胞色素P450(CYP)转变为活性代谢物发挥抗血小板作用。在临床应用方面，氯吡格雷使用非常特殊，如果其活性成分在血液中浓度过高将导致出血，而浓度过低则会导致血管栓塞等副作用。氯吡格雷在血液中活性成分的浓度高低与个体遗传背景密切相关。因而，影响CYP功能降低的基因突变会减少氯吡格雷活性代谢产物的血药浓度，从而限制了氯吡格雷的效用，严重者产生副作用。大量的研究表明，CYP2C19的基因突变与CYP功能降低有关。其中，CYP2C19*2与低浓度的氯吡格雷活性产物密切相关。原因主要有两个方面，一方面，CYP2C19功能丧失(LOF)基因型[特别是CYP2C19*2，(rs4244285，c.681G＞A)]携带者体内氯吡格雷的活性代谢物水平较低。另一方面，积累的研究表明，CYP2C19*2的分布频率高于其他基因突变。

目前，指导临床用药标准，现代最精准的是检测基因型。在2011年在美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)对氯吡格雷发出黑框警告：氯吡格雷代谢较慢者不能有效地将其转化为活性产物因而不能充分发挥抗血小板效应，医务人员应根据患者的情况进行CYP2C19基因检测，对突变型患者考虑选用其他抗血小板药物或调整氯吡格雷的治疗剂量。因此，有效检测CYP2C19*2的基因型有利于指导该药物个体化治疗，同时推进精准医学的发展。目前，已经报道的检测CYP2C19*2的常规技术有DNA测序、实时定量聚合酶链反应(qPCR)和限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)。然而，这些方法存在样品处理繁琐、成本高、需要高精度设备，不能实现对该基因的快速定量分析。因此，寻找具有高性价比、高度灵敏的检测方法实现对CYP2C19*2的快速定量检测是当前急需解决的问题。

在电化学生物传感器分析技术中，为了提高检测的灵敏度和缩短响应时间，满足临床上痕量物质的定量快速检测，目前多采用“三明治”型的传感器反应模式。其原理是基于构建负载捕获探针(CP)-被测目标DNA(TP)-标记信号探针(SP)夹心生物复合物的分析方法。其中，信号探针标记物主要起到增强、放大信号、提高检测灵敏度的作用，故具有举足轻重的地位。本实验拟采用羧基化的富勒烯(c-C₆₀)、二氧化铈(CeO₂)、铂纳米粒子(PtNPs)合成新的信号纳米材料复合物，用于固载信号探针，通过催化过氧化氢产生电信号来实现信号放大，最终实现血液中痕量DNA的检测。二氧化铈(CeO₂)纳米颗粒由于其较强的吸附能力，独特的辅助催化性能和能够增强电极与电极修饰材料之间的电子转移效应而受到极大地关注。由于上述优点，CeO₂已广泛应用于催化领域。然而，CeO₂在生物传感器中的稳定性还有待提高。为了解决这一问题，本实验使用c-C60这一稳定性高，比表面积大，机械性能好，分散性好的纳米材料。不仅可作为载体来固载更多的CeO₂，而且可以提高CeO₂的稳定性。此外，为了充分发挥CeO₂的辅助催化作用，本课题引入PtNPs。由于其具有显著的电催化活性、对氨基和硫醇基团的强吸附力，它不仅可以用于催化过氧化氢放大电化学信号，而且可以固载氨基修饰的信号探针。总的来说，CeO₂和PtNPs具有协同催化过氧化氢作用，从而实现了信号放大，c-C₆₀在固载更多的CeO₂和PtNPs的同时，增加了信号材料的稳定性。而且因为有PtNPs的存在，也可以与信号探针结合，通过信号探针与目标序列的特异性结合可以用于构建夹层型生物传感器。

该项目建立了一个简单、快速的检测方法实现了对CYP2C19*2的特异、超灵敏检测。为临床治疗心血管相关疾病提供了个体化用药的指导方法。

发明内容：