[发明专利]利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法及引物

说明书

本发明公开了一种利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法及引物。所述方法包括：提取待检测样品的DNA；以所述的DNA为模板，利用所述的引物进行LAMP反应；对反应产物进行鉴定，判断待检测样品中是否含有蜡样芽孢杆菌。发明针对蜡样芽孢杆菌毒力基因的保守序列设计引物，并进一对LAMP反应体系进行优化，可稳定、高特异性、高灵敏度的检测蜡样芽孢杆菌。

技术领域

本发明涉及食源性致病微生物的检测，尤其涉及一种利用环介导等温扩增技术检测食源性蜡样芽孢杆菌的方法。

背景技术

目前对于细菌的检测方法主要有细菌分离培养鉴定方法、免疫学检测方法、病理组织切片方法和分子生物学方法。

细菌分离培养鉴定是应用液体培养基、半固体培养基或固体培养基将分离得到的疑似细菌进行培养，并应用溶血实验、运动性实验、产酸产气等生化实验及染色镜检对微生物进行诊断。目前，在我国境内最常见也是应用最广泛的是国标法(GB4789.30-94)，还有其他的分离鉴定方法如FDA(美国食品药品监督管理局)法、改良FDA法、行标法(SN)和GNFIS法等。这类方法在目前所有类型的检测方法中的准确性是最高的，但是无论是哪种分离培养技术，他们都有一个共同的缺点，就是从样品的采集到病原微生物的分离鉴定结果，需要的试验周期都会很长，一般微生物的培养需要2天左右，鉴定的所需要的时间和结果在一个星期左右，有些微生物的分离培养需要十多天，才得的出结果。因此，此类方法不能够适应目前快速、准确的诊断需求市场。同时由于操作的过程中，接触活体的细菌，对操作人员构成一定的健康威胁。

免疫学检测方法的原理是根据抗原-抗体结合形成沉淀的复合物，常见的方法包括凝集反应方法、沉淀反应方法、免疫荧光技术、放射免疫测定方法、酶联免疫吸附试验、补体结合试验等。免疫学检测方法是基于抗原与抗体特异性结合的原理进行检测的一种血清学方法。这种诊断方法的缺点是检测过程中，需要的试剂非常昂贵，同时此方法在检测过程中，根据不同的检测目标微生物，其特异性也不尽相同，容易出现假阳性结果，造成误判。同时人为的操作对于实验结果的影响也是有的，所以需要具有一定素质和能力的实验室专业人员。

病理组织切片方法是取一定大小的病变组织，用病理组织学方法制成病理切片〔通常将病变组织包埋在石蜡块里，用切片机切成薄片，再用苏木精－伊红(H-E)染色〕，用显微镜进一步检查组织的病变。根据病变的发生发展过程，最后作出病理诊断。这种检测方法虽然准确性很高，但是最大的问题是，对从事病理组织学诊断的人员的专业性的要求会非常高，需要专业的病理组织学教师或者从事病理组织学研究的研究生，才有可能进行准确的诊断，也可以说这类诊断方法需要在显微病理学知识上具有丰富经历和经验的实验人员。

分子生物学是在分子水平上研究生命现象物质基础的学科。常见的应用于检测微生物方法有核酸(DNA)的凝胶电泳实验、核酸的分子杂交实验、核酸的体外扩增实验等方法，这些方法的优点是检测方法的特异性非常理想，检测时间最快可以在6小时内完成。本方法的缺点在于，需要昂贵的变温反应设备和检测仪器。分子生物学诊断方法在实验过程中需要复杂的变温仪器，这种仪器的价格很高，对于基层的投放使用很难做到全覆盖。

蜡样芽孢杆菌食物中毒有明显的季节性，特别容易在6～10月份生长繁殖，发生食物中毒事件的概率与人类的活动密切相关。引起机体产生中毒的食品，通常是因保存的食物存放时间过长，存放的环境温度过高高或食品在加热过程中不彻底，导致细菌芽孢生长，致使该菌在食物中大量繁殖，产生毒素，从而导致中毒。中毒者症状为腹痛、呕吐、腹泻。

蜡样芽孢杆菌产生的芽孢是导致食源性疾病的一个重要因子，芽孢对高温、干燥、紫外线、电离辐射、有毒化学物质以及其他不利的环境因素都有非常强的抵抗能力。有研究报道从2500万～4000万年的琥珀中和贴有2.5亿年的盐水包含物中成功复活芽孢。一些蜡样芽孢杆菌的芽孢比嗜温型枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的芽孢更耐热，能够经受烹调食品中的很多程序。研究报道称通常的食品加热烹调(热冲击)无法杀死该菌的芽孢，芽孢会残存并发芽，从而导致生产的食物受污染。因此，蜡样芽孢杆菌难以杀灭的特性是导致其容易造成食品污染并致病的主要原因。