[发明专利]一种糖肽或糖蛋白富集材料及其制备和应用

说明书

本发明属糖肽/糖蛋白富集材料和分析技术领域，涉及一种基于酰肼策略的糖链可释放糖基化肽段/蛋白富集材料及其制备方法和应用。通过化学反应在基质微球表面键合含有二硫键的酰肼化合物，形成表面具有酰肼基团的可用于糖肽富集的功能材料。本发明在材料表面通过引入二硫键而实现糖肽/糖蛋白的糖链可释放的富集，与糖链之间采用共价结合的方式，具有富集效率高的优势，而且克服了传统酰肼法中糖链不易释放，不能用于O‑糖基化肽段/蛋白富集的缺点。本发明提供的糖链可释放的富集材料易于制备，富集选择性好，能广泛适用于N‑糖基化和O‑糖基化肽段/蛋白的富集，在糖蛋白质组学等领域有很强的实用价值。

技术领域

本发明涉及一种基于酰肼策略的糖链可释放糖基化肽段/糖蛋白富集材料及其制备方法，以及其在糖蛋白质组学中的应用。

背景技术

蛋白质的糖基化是生物体内最重要、最常见的翻译后修饰之一，与细胞粘附、信号转导、细胞凋亡、免疫应答等生物学过程及生理机能密切相关(Rudd,et al.Science 2001,291,2376-2378)。糖蛋白作为重要的生物标志物，目前已被广泛应用于疾病的诊断、预警和药效评价(Overath,et al.Mol.Cell.Proteomics 2012,11,467-477)。鉴于糖基化修饰在生命活动中的重要意义，糖基化蛋白质组学作为蛋白质组学的一个重要分支，也受到越来越广泛的关注。但糖基化蛋白质组研究对象复杂：糖蛋白翻译后修饰种类繁多、丰度低，质谱响应信号差。当前解决这一问题的重要途径是发展新型功能材料以实现糖基化蛋白质高选择性富集。

酰肼化学法是利用高碘酸氧化糖蛋白或糖肽糖链上的顺式邻二羟基后产生的醛基与含有酰肼基团的固相颗粒结合，从而实现对糖基化蛋白质/肽段的特异性富集。主要包括(1)氧化，糖链上的顺式邻二羟基在高碘酸盐作用下被氧化生成醛基；(2)偶联，生成的醛基与基质材料上的酰肼基团反应形成共价腙键，从而实现糖蛋白/糖肽的特异性捕获；(3)洗脱，先洗脱掉体系中未发生共价结合的蛋白质或肽段，再经过糖苷酶处理释放出糖基化的蛋白质或肽段进而进行下一步的质谱分析。酰肼化学法对糖链不存在歧视效应，共价结合的方式富集效率高，在高通量的糖基化位点尤其是N-型糖基化位点鉴定中，得到了很好的应用。但由于缺乏合适的糖苷酶，酰肼方法不适用于O-型糖基化位点的鉴定。

针对上述问题，我们设计了一种糖链可释放糖基化肽段/蛋白富集材料。本发明提供的富集材料易于制备，富集选择性好，能广泛适用于N-糖基化和O-糖基化肽段/蛋白的富集，在糖蛋白质组学等领域有很强的实用价值。

发明内容

为了解决上述问题，本发明目的在于提供一种基于酰肼策略的糖链可释放糖基化肽段/蛋白富集材料及其制备方法。该富集材料不仅可以实现广泛的N-糖基化和O-糖基化肽段/蛋白的富集，而且制备方法简单普适，容易实现。为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1、巯基微球颗粒的制备：对于硅胶颗粒，加硅球于反应容器，分散于甲苯溶剂中，超声分散均匀，加入硅烷化试剂，通氮气0-50分钟，机械搅拌，保持转速300rad/min，加热回流6-30小时，停止反应后，冷却至室温，使用高速离心机用2500～10000rad/min的速度离心3-5分钟，弃上清液，固体颗粒依次使用甲苯、丙酮、甲醇抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3-5遍，50℃真空干燥箱内真空干燥6-30小时，得到带巯基的硅胶颗粒。

其中，硅烷化试剂为含有巯基的硅烷化试剂。硅胶颗粒占总质量的0.02～0.25wt％，单体的总摩尔数浓度为0.04～1mol/L，余量为反应溶剂。