[发明专利]一种用于检测禽腺病毒IV型的特异性引物及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测禽腺病毒IV型的引物及应用。是根据禽腺病毒IV型penton基因序列保守区域设计的一对特异性引物，扩增的目的片段498bp。本发明的特异性引物，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏对禽腺病毒IV型进行准确鉴定。最低检测限达2.7×10^‑4ng/ul，而对禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒（IBV H120株）、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡毒霉形体、禽呼肠孤病、鸡马立克病病毒、减蛋综合征病毒、鸡大肠杆菌、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭瘟病毒的检测结果均为阴性。对87份临床样品检测结果显示，检出阳性样品14份，阳性感染率为16.09%。

技术领域

本发明属于动物卫生检验技术领域，涉及用于检测禽腺病毒IV型的特异性引物及应用，特别是针对禽腺病毒IV型penton基因的PCR引物及其应用。

背景技术

禽腺病毒（Fowl adenovirus ，FADV）属于禽腺病毒科、禽腺病毒属。根据其抗原性不同可将禽腺病毒分为3个群：Ⅰ群禽腺病毒具有共同的群抗原，其代表株为鸡胚致死孤儿病毒（CELOV），根据中和试验可将其分为12个血清型（FAdV1-12）；Ⅱ群禽腺病毒和Ⅲ群禽腺病毒主要包括火鸡出血性肠炎病毒（HEV）和减蛋综合征（Egg drop syndrom virus，EDSV）。

禽腺病毒IV型属于Ⅰ群禽腺病毒，主要感染3-5周龄的肉鸡、种鸡及蛋鸡，病程8-15天，死淘率10%-80%，病鸡采食量迅速下降，表现为精神沉郁，拉淡黄绿色稀便，剖检可见心包积液，肝脏肿大，呈现黄色或黄绿色，脾胃与肌胃交界处偶有出血点。临床以心包积液和包涵体肝炎为主要特征。该病毒主要通过鸡胚垂直传播，也可经粪便、气管和鼻腔粘膜水平传播。

五邻体（penton）、六邻体和纤维蛋白是FADV的3个主要结构蛋白，它们共同构成病毒核衣壳。每个五邻体由基底和伸出表面的一根末端有顶球的纤维组成，有助于病毒黏附于细胞表面。该蛋白还可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。此外，五邻体能刺激机体产生抗体，从而中和病毒体，在鸡抗禽腺病毒感染中发挥重要作用。因此 五邻体蛋白在FADV的致病机制、临床诊断和免疫等研究方面均具有重要意义。

目前检测禽腺病毒的方法有病毒分离与鉴定、病毒中和试验等,谢芝勋（2000年）、文艳玲（2008年）等根据hexon基因设计引物, 建立了Ⅰ群FADV的PCR检测方法及SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,唐熠等（2009年）以hexon为靶基因建立了LAMP检测方法，并在该病检测诊断上得到应用。本发明根据GenBank中登录的FADV penton基因序列，并兼顾FADV不同国家毒株间的差异，选择FADV的保守的核苷酸序列作为扩增区域，设计了一对检测禽腺病毒IV型penton基因的PCR引物。对该引物的特异性、敏感性和重复性进行试验，证实此引物可用于快速、方便、高效地检测禽腺病毒IV型，特异性好，灵敏度高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测禽腺病毒IV型penton基因的特异性引物，它具有快速、方便、高效、灵敏度高的特点，其特征在于：

上游引物FADV4-F：5'-ACAGCCGTGCGCACCAACTGCCCGAAC-3'；

下游引物FADV4-R：5'-CTGCAGATCCTCGTAGGTAATAAC-3'

扩增的禽腺病毒IV型penton基因目的片段为498bp。

本发明进一步公开了用于检测禽腺病毒IV型penton基因的特异性引物进行检测的方法如下：

（1）提取病毒DNA；

（2）PCR扩增反应：