[发明专利]一种治疗难治性皮肤破损的生物凝胶剂及其应用

权利要求书

1.一种中药提取物，其特征在于，所述的中药提取物的制备方法包括以下步骤：按重量份称取充分干燥的物料：芦根15-25份、蓝莲花8-12份、木槿花6-8份、甘草1-3份，用75％-85％乙醇浸泡50-70分钟，并用组织破碎器磨碎；用超声波破碎，功率500-700W，时间20-40分钟，10000-15000rpm离心10-20min，取上清，然后用乙醇定容；用和定容液等体积的水饱和正丁醇进行萃取，共萃取4-6次；将回收的正丁醇溶液用负压离心机抽干，残留物用无水乙醇溶解。

2.一种干细胞培养添加剂，其特征在于，所述的干细胞培养添加剂由干细胞提取物、中药提取物和血清组成，三者体积比为1:(18-30):(2-4)；所述的干细胞提取物的制备方法为：将华通氏块碎块用含胶原酶II的DMEM培养基消化，过滤后使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基传代培养，再换用无血清DMEM培养基传代培养，2天传代一次，收集传代3-5代的细胞进行后续处理；用含EDTA的DMEM培养基消化细胞，并用PBS溶液清洗，再用无血清DMEM培养基重悬，超声波裂解破碎细胞，破碎产物离心后取上清；将上清用孔径为5000埃的滤器过滤；所述的中药提取物如权利要求1所述，且其总黄酮含量不小于20mg/L；所述的血清选自去蛋白胎牛血清、健康人血清和患者自体血清中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述的干细胞培养添加剂，其特征在于，所述的超声波裂解破碎细胞，其具体参数是100-150W，10-20S，15-25次，10-20S间隔。

4.根据权利要求2所述的干细胞培养添加剂，其特征在于，所述的用孔径为5000埃的滤器过滤，具体是使用超滤管超滤提纯和浓缩，时间为25-40min，压力为0.25-0.35MPa。

5.一种治疗难治性皮肤破损的生物凝胶剂，其特征在于，所述的生物凝胶剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一：分离培养脐带间充质干细胞

将分离的脐带间充质干细胞使用含10％胎牛血清FBS的DMEM培养基进行传代培养；第三天换用无血清DMEM培养基进行传代培养，2天传代一次，培养到第5代后，将培养基替换为含4％-6％FBS和体积浓度8％-12％权利要求2所述干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第6代后，将培养基替换为含体积浓度8％-12％权利要求2所述干细胞培养添加剂的DMEM培养基并传代培养；当脐带间充质干细胞培养到第7代后即进行液氮保存或后续使用；

步骤二：制备生物凝胶剂

将步骤一培养的脐带间充质干细胞用凝固剂包裹，制备成含细胞的水溶剂，脐带间充质干细胞终浓度为(1-5)*10⁴个/ml；所述的凝固剂选自葡聚糖和壳聚糖配方、透明质酸和甲基纤维素配方以及改性聚乙二醇配方中的一种或几种；

所述的葡聚糖和壳聚糖配方包括：

凝固剂A1：制备方法如下：明胶用磷酸盐缓冲液溶解，终浓度4％-6％，加入12-18ml乙二胺，调整pH至4.5-6.5，加入2-2.5g1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，室温反应过夜，用PBS透析后冻干并液氮保存；

凝固剂B1：主要成分为氧化葡聚糖和酸化壳聚糖，氧化葡聚糖制备方法如下：将葡萄糖制备成8％-12％水溶液，加入6-6.5g过氧碘酸钠，避光反应3.5-4.5小时后加入1.5-2.5ml乙二醇，用水透析66-78小时后冻干并液氮保存；酸化壳聚糖制备方法如下：将壳聚糖用1.8％-2.2％丙烯酸溶解，55-65摄氏度反应42-54小时后用丙酮沉淀提纯，产物用水溶解后加入0.4％-0.6％京尼平，避光反应20-28小时后超滤，冻干并液氮保存；上述两种成分按(18-22):1的比例混合即为凝固剂B1；

所述的透明质酸和甲基纤维素配方包括：

凝固剂A2：由II型胶原蛋白、透明质酸和矿物油组成，三者重量比为：(3-3.5):(6-7):1；

凝固剂B2：制备方法如下：将甲基纤维素用pH＝11-13的氢氧化钠溶液溶解，调整浓度至3.5％-4.5％，55-65摄氏度反应3.5-4.5小时；

改性聚乙二醇配方包括：

凝固剂A3：为含有细胞维持剂的三乙醇胺溶液，细胞维持剂包括10μg/L Ternessin-C和细胞因子，所述的细胞因子包括10μg/L血管内皮生长因子、20μg/L成纤维细胞生长因子、5μg/L表皮生长因子和5μg/L干细胞生长因子，还包括三乙醇胺磷酸盐缓冲液，三乙醇胺浓度为0.49％，pH7.0；

凝固剂B3：4臂-聚乙二醇-乙烯砜。