[发明专利]一种脂肪干细胞提取方法

权利要求书

1.一种脂肪干细胞提取方法，其特征在于，包括：

A、预处理脂肪组织；

B、向所述预处理后的脂肪组织加入I型胶原酶进行消化；

C、消化预定的时间后，收集位于下层的已消化的脂肪细胞；

D、吸取位于上层的未消化脂肪细胞以及I型胶原酶重新进行消化；

E、重复执行步骤C和步骤D，直至所述预处理后的脂肪细胞被消化完全；

F、培养若干代所述已消化的脂肪细胞，获得传代细胞；

G、收集所述传代细胞并进行若干项细胞检测；

H、在所述细胞检测项目合格后，将所述传代培养细胞转移至细胞种子库中存储。

2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤A具体包括：

A1、获取脂肪组织样本；

A2、使用生理盐水清洗所述脂肪组织样本；

A3、将所述清洗后的脂肪组织样本分装至若干支离心管并剪碎。

3.根据权利要求2所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤A2具体包括：

A21、将脂肪组织样本分装至若干支离心管中；

A22、向离心管中加入生理盐水以补充至预定的体积；

A22、使用移液管反复吹打在所述离心管内的脂肪组织样本；

A23、将离心管放入离心机中离心10分钟，转速为1500rpm；

A24、弃去离心管内的中下层液体；

A25、重复执行步骤A22至A24，直至中下层液体清亮。

4.根据权利要求3所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述I型胶原酶为使用DPBS配置的无菌I型胶原酶，浓度为1mg/ml。

5.根据权利要求4所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述预定时间为1小时。

6.根据权利要求5所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤B具体包括：

B1、向装有所述剪碎后的脂肪组织样本的离心管中加入I型胶原酶并混合均匀；

B2、将混合均匀的离心管放入37℃恒温摇床中进行消化，所述37℃恒温摇床的转速为250转/分钟。

7.根据权利要求5所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤C具体包括：

消化1小时后，将所述离心管放入离心机中离心6分钟，转速为1200rpm。

8.根据权利要求4所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤D具体包括：

D1、收集位于下层的细胞沉淀并使用DPBS重悬；

D2、对所述细胞沉淀重悬并进行离心，所述离心的时间为6min，转速为1200rpm；

D3、弃去离心后的上清。

9.根据权利要求8所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，所述步骤F具体包括：

F1、使用脂肪间充质干细胞完全培养基，将所述已消化的脂肪细胞重悬并调整细胞密度至2×10⁴/cm²，接种在培养瓶中；

F2、在将所述接种有所述已消化的脂肪细胞的培养瓶放置于二氧化碳培养箱中静置培养；

F3、当细胞融合度达70～80％时，倾出培养瓶内的培养基并加入20m l生理盐水洗涤；

F4、向所述培养瓶内加入胰蛋白酶消化液，静置消化3分钟后，加入生理盐水终止消化；

F5、从所述培养瓶中收集细胞悬液并离心去上清，获得脂肪间充质干细胞，记为细胞代次PO；

F6、将细胞代次为P0的脂肪间充质干细胞按2×10⁴/cm²的密度，接种在培养瓶中；

F7、重复执行步骤F2、F3和F4；

F8、从所述培养瓶中收集细胞悬液并离心去上清，获得脂肪间充质干细胞，记为细胞代次P1。

10.根据权利要求8所述的脂肪干细胞提取方法，其特征在于，在所述步骤G之前，所述方法还包括：

G01、将细胞代次为P1的脂肪间充质干细胞按照1×10⁷/ml/支的容量，分装至若干支冻存管内；

G02、向所述冻存管加入冻存液；

G03、依照预定的降温程序，降低所述冻存管至目标温度后，将所述冻存管放置到暂存罐内。