[发明专利]利用花药培养快速选育广亲和水稻材料的方法

说明书

技术领域

本发明涉及花药培养快速选育广亲和水稻材料的方法，主要用于水稻籼粳杂种优势利用和水稻分子标记辅助育种研究领域。

背景技术

水稻分籼、粳两个亚种，亚种间的杂种一代具有强大的杂种优势，水稻籼粳亚种间杂种优势的利用是进一步提高水稻单产的重要途径之一。但籼粳亚种间杂种一般结实率偏低、籽粒充实度差，这些问题制约了亚种间杂交稻的利用。水稻广亲和基因S5ⁿ可克服籼粳生殖障碍，与籼稻或粳稻亚种杂交均能产生正常可育的后代。培育和利用广亲和水稻品种是促进水稻籼粳杂种优势、进一步提高水稻产量的当务之急。但已知的广亲和品种多为农艺性状欠佳的农家品种，不能直接作为亲本使用；而常规育种方法选育优良性状的广亲和品种，需要杂交、回交转育，耗时冗长育种周期长。近年来育种家们育成了甬优12、浙优18、春优84等一批综合性状优良的籼粳亚种间组合，为进一步利用籼粳间杂种优势奠定了良好的基础。水稻花药培养可以快速获得纯系、提高选择效率、有效缩短育种周期。但是水稻花药培养的愈伤组织诱导率及绿苗分化率受基因型影响较大，且目前尚未见到利用生产上推广的籼粳杂交甬优系列品种进行水稻花培获得纯合DH(双单倍体)系、并进一步获得具有广亲和基因S5ⁿ的广亲和水稻材料报道。

发明内容

本发明的目的是针对当前我国水稻生产中缺少广亲和水稻品种的现状，提供利用花药培养快速选育广亲和水稻材料的方法，方法快速，有效。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

利用花药培养快速选育广亲和水稻材料的方法，包括下述步骤：

1、花药培养再生植株的获得

(1)预处理：新鲜水稻幼穗，75％酒精表面消毒后，用保鲜膜包好幼穗，4℃冰箱中预处理7-10天；

(2)诱导培养：预处理结束后，剥去多余叶片和叶鞘，留取发育适宜的带枝小穗，装入无菌烧杯中，先用75％酒精表面消毒30s，再用0.1％升汞溶液浸泡10-12min，并用无菌水冲洗3-4次，每次1-2min，最后用无菌滤纸吸干小穗水分；在超净工作台上从颖壳基部1/3处剪断花丝，将花药抖落至诱导培养基上，每个三角瓶约接种80-100个花药，25-28℃暗培养；

所述的诱导培养基为N6+2，4-D 2.0-3.0mg/L+KT 0.5-1.5mg/L+NAA2.0-3.0mg/L+蔗糖30-50g/L；

(3)分化培养及生根：愈伤组织直径达到2mm时将其转移到分化培养基，25-28℃、1000-1500Lx、10-12h/d光照培养直至分化成绿苗；当绿苗长到5cm时，在超净工作台上将绿苗转移到生根培养基上进行生根；

所述的分化培养基为：MS+KT 2.0-3.0mg/L+6-BA2.0-3.0mg/L+NAA 0.2-0.8mg/L+IAA0.2-0.8mg/L+蔗糖30g/L；

所述的生根培养基的配方包括：1/2MS+NAA0.5-1.0mg/L+活性炭0.8-1.0g/L+蔗糖20g/L；

2、纯合DH系的获得

将根系发育良好的再生植株经过炼苗后大田移植，每个愈伤组织来源的植株单株收种，每个单株获得的种子次年种成株系，通过田间农艺性状调查，选取田间农艺性状纯合株系10-30个。结合室内考种，选取农艺性状优良结实率高丰产性好的DH系5-15个。

3、广亲和水稻材料的获得

针对广亲和基因S5ⁿ设计引物，对选取的DH系进行PCR电泳，筛选具备该基因的植株，即得。

以上所述的方法中，优选的，所述的水稻的品种为水稻甬优系列，最佳选择为甬优1540；

以上所述的方法中，优选的，新鲜水稻幼穗的获取方法为：于晴天的下午取单核靠边期的幼穗，为保证幼穗新鲜，取样时幼穗留2节及2-3片叶片，放在盛有清水的桶中。取好的幼穗在室内显微镜下观察花粉母细胞发育时期，花粉发育处于单核靠边期的幼穗叶枕距8-10cm，此时幼穗的颖壳宽度已接近成熟的大小，颖壳呈现淡绿色，雄蕊伸长达颖壳的1/3－1/2；田间取回的幼穗，在实验室里重新修剪，保留幼穗2叶及1节，75％的酒精表面消毒后，用保鲜膜包好幼穗，放在4℃冰箱中预处理7-10天。

以上所述的方案中，优选的，针对广亲和基因S5ⁿ设计的正向引物(F1)序列为5’-ATCAACCCATTTCCTTTCCT-3’，反向引物(R1)序列为5’-ATACGCTCGATCGGATTAAC-3’；