[发明专利]转基因蛋白CP4EPSPS的上转换‑免疫层析试纸条及检测方法

权利要求书

1.检测转基因蛋白CP4EPSPS的上转换-免疫层析试纸条，其特征在于：所述试纸条包括样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫，所述样品垫与结合垫为玻璃纤维素膜，所述分析膜为硝酸纤维素膜，所述吸水垫为纤维素膜，所述分析膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、结合垫、吸水垫依次粘贴在PVC板上；

所述结合垫上固定有上转换发光纳米粒子-转基因蛋白CP4EPSPS单抗1结合物；

所述分析膜上的检测线固定有转基因蛋白CP4EPSPS单克隆抗体2，所述质控线固定有二抗。

2.根据权利要求1所述的检测转基因蛋白CP4EPSPS的上转换-免疫层析试纸条，其特征在于：所述样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫依次以重叠1～2mm的间距交互层叠黏贴到PVC板上，所述试纸条的宽度为4mm。

3.权利要求1～2任一项所述的检测转基因蛋白CP4EPSPS的上转换-免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：

(1)NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄上转换纳米粒子的制备；

(2)NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄的高分子的包覆；

(3)上转换纳米粒子标记抗体；

(4)上转换免疫层析法的试纸条的制作；

(5)结合物溶液的配置和包被；

(6)质控溶液和检测溶液的配置和包被；

(7)双抗体夹心模式UCPs-ICA定量检测转基因蛋白CP4EPSPS。

4.根据权利要求3所述的检测转基因蛋白CP4EPSPS的上转换-免疫层 析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄上转换纳米粒子的制备方法如下：

S1：NaYF₄:Yb,Tm的制备

往三口烧瓶中加入2～5mL油酸，再加入1.2～3mmol稀土离子氯化物晶体粉末，控制各种稀土元素的摩尔比例为Y:Yb:Tm＝60％:25％:4％。在稀有气体氩气流的保护下，隔绝空气加热到110～130℃，保温20min。迅速加入5～14mL 1-十八烯，然后慢慢加热到150℃，慢慢滴加10mL溶解NH₄F和NaOH的甲醇溶液到上述体系中，其中NH₄F为6mmol,NaOH为3mmol，滴加完毕50℃继续搅拌40min，慢慢升温至100℃，抽真空，在Ar气保护下迅速升温至300℃，反应60～80min。反应完毕后，冷却至室温，反应产物在5000rpm下离心6min，沉淀用乙醇反复洗涤2-3次，最后将所得产品溶于5mL环己烷中保存待用；

S2：NaYF₄:Yb,Tm/NaYF₄的制备

将2～5mL油酸加入圆底烧瓶中，再加入0.5mmol YCl₃·6H₂O晶体粉末，加热到140℃使晶体粉末溶解完全，并除去结晶水，升温到150℃，保温20min，迅速加入5～13mL1-十八烯，并加热到120℃，保温30min，反应完毕并冷却到50℃，此时交替滴加5mL上述NaYF₄核的环己烷溶液和4～8mL含有4mmol NH₄F、2.5mmol NaOH的甲醇溶液，滴加完毕，恒温搅拌40min,慢慢升温到100℃除尽环己烷和甲醇，迅速升温到300℃反应90min，反应完毕后冷却到室温，烧瓶内的反应产物5000rpm离心5min,沉淀用乙醇反复洗涤2-3次。将所得淡黄色上转换纳米颗粒溶解于10mL氯仿中保存待用。

5.根据权利要求3所述的检测转基因蛋白CP4EPSPS的上转换-免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的制备方法如下：

准确称取1～5mg两亲性嵌段共聚物于圆底烧瓶中，加入体积比为1：3的氯仿和乙醇的混合溶液，然后加入200uL步骤(1)制备好的上转换纳米粒子，混合均匀，将混合物置于旋转蒸发仪上，保持35℃水浴恒温，减压使其缓慢蒸干，再加入5mL弱碱性的磷酸盐缓冲溶液，悬浊液呈白色，离心洗涤5～10次，离心管底部的粒子用10mL pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解，得到pH中性的Poly-NaYF₄:Yb,Er/NaYF₄的悬浊液，4℃避光保存备用。