[发明专利]一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇

权利要求书

1.一种化合物balanol的生物合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将blnR基因片段连入载体中，得到表达质粒；

所述的blnR基因片段，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；2)将表达质粒利用电转化转入根癌农杆菌EHA105，经链霉素和卡那霉素抗性筛选培养，挑菌落PCR鉴定，得到带有表达质粒的农杆菌；

3)将带有表达质粒的农杆菌单克隆接种于液体培养基避光振荡培养，取培养液，重悬菌体至OD₆₀₀0.1-0.15，然后再避光振荡培养，使OD₆₀₀达到0.5-0.6，得到重组农杆菌EHA105菌液；

4)培养大团囊虫草，收集大团囊虫草分生孢子，经血球计数板计数调整孢子浓度至(0.5～5)*10⁶个/ml，得到大团囊虫草菌分生孢子悬浮液；

5)取重组农杆菌EHA105菌液和大团囊虫草菌分生孢子悬浮液混合，避光共培养，得到共培养混合菌体；

6)用无菌水洗涤共培养混合菌体，之后涂布于平板上，倒置培养至转化子出现，将转化子转接到选择性平板上进行继代培养3-5次，经PCR鉴定，得到OE::blnR大团囊虫草转化子；

7)将鉴定正确的OE::blnR大团囊虫草转化子发酵培养，发酵液经分离得到化合物balanol。

2.根据权利要求1所述的化合物balanol的生物合成方法，其特征在于，步骤4)中，调整孢子浓度至(0.5～2)*10⁶个/ml。

3.根据权利要求1所述的化合物balanol的生物合成方法，其特征在于，步骤5)中，所述的避光共培养的条件为：在24℃～28℃避光共培养36h～60h。

4.据权利要求1所述的化合物balanol的生物合成方法，其特征在于，步骤6)中，在24℃～28℃倒置培养至转化子出现。

5.据权利要求1所述的化合物balanol的生物合成方法，其特征在于，步骤6)中，将转化子转接到选择性平板上进行继代培养3-4次。