[发明专利]一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇

说明书

本发明公开了一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇，该生物合成方法高效，方便，包括：将blnR基因片段连入载体中，得到表达质粒；将表达质粒利用电转化转入根癌农杆菌EHA105，筛选培养，得到带有表达质粒的农杆菌；接种于液体培养基避光振荡培养，取培养液，然后再避光振荡培养，得到重组农杆菌EHA105菌液；收集大团囊虫草分生孢子，得到大团囊虫草菌分生孢子悬浮液；取重组农杆菌EHA105菌液和大团囊虫草菌分生孢子悬浮液混合，避光共培养，得到共培养混合菌体；得到OE::blnR大团囊虫草转化子，发酵培养，发酵液经分离得到化合物balanol。

技术领域

本发明涉及化合物balanol的生物合成技术领域，具体涉及一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇。

背景技术

真菌天然产物是人类天然药物来源的宝库，但很多基因簇在自然条件下是隐性的，近年来的许多新技术进展，包括测序、检测手段，使得激活新产物越来越容易。大团囊虫草是一种被用于治疗血崩、月经不调等病症的传统中药分布于亚洲、欧洲等。

通过基因组测序，发现了大团囊虫草基因组序列中含有一个AflR调控因子的PKS-NRPS杂合基因簇，但在发酵产物中，没有检测到可以和该基因簇相对应的产物，推测其为一个隐形基因簇。通过构建其中的特异性调控因子blnR的过表达载体，经过液体摇瓶发酵培养和HPLC检测，确认激活了该PKS-NRPS混合基因簇，通过分离纯化，得到了balanol及其他新产物。

化合物balanol的结构如下所示：

balanol具有很强的PKC抑制剂活性，其三维结构与ATP相似，而其与PKC和PKA蛋白激酶的ATP结合口袋相结合的亲和力是ATP的3000倍，PKA和PKC是肿瘤学中的重要靶点。1993年balanol首先从真菌Verticillium balanoides中被分离鉴定，1994年确认了与1977年在大团囊虫草中发现的ophiocordin是同一种物质。因为真菌中的balanol天然产物量极少，为拓宽balanol的使用意义，balanol及其衍生物的化学合成，此前诸多研究对其进行了体外的化学全合成研究，而这些方法大都费时费力，本发明中的生物合成方法高效，方便，为后续的balanol结构及衍生物合成活性研究提供了新手段。

发明内容

本发明提供了一种化合物balanol的生物合成方法及基因簇，该生物合成方法高效，方便，在真菌大团囊虫草(Tolypocladium ophioglossoides)中实现balanol高效生物合成的方法。本发明是利用农杆菌介导的T-DNA转化法构建大团囊虫草(Tolypocladiumophioglossoides)中的转化体系，过表达途径特异性调控因子blnR，激活原本在实验室条件下沉默的balanol合成基因簇，经液体发酵后通过HPLC检测发酵液中balanol的产生，经过分离纯化得到生物合成的balanol。

一种化合物balanol的生物合成方法，包括以下步骤：

1)将blnR基因片段连入载体中，得到表达质粒；

2)将表达质粒利用电转化转入根癌农杆菌EHA105，经链霉素(Str)和卡那霉素抗性筛选培养，挑菌落PCR鉴定，得到带有表达质粒的农杆菌；

3)将带有表达质粒的农杆菌单克隆接种于液体培养基避光振荡培养，取培养液，重悬菌体至OD₆₀₀0.1-0.15，然后再避光振荡培养，使OD₆₀₀达到0.5-0.6，得到重组农杆菌EHA105菌液；

4)培养大团囊虫草，收集大团囊虫草分生孢子，经血球计数板计数调整孢子浓度至(0.5～5)*10⁶个/ml，得到大团囊虫草菌分生孢子悬浮液；