[发明专利]GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用。本发明通过基因工程技术成功构建GDF11原核表达载体，利用发酵生产、镍柱分离纯化得到GDF11蛋白，本发明通过茜素红染色以及成骨相关基因蛋白的检测探究GDF11对脂肪干细胞成骨分化影响，发现GDF11可以诱导ASCs成骨分化，并且本发明还证实了GDF11是通过激活BMP途径诱导ASCs的成骨分化，为GDF11的临床应用奠定了理论基础。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用。

背景技术

生长分化因子-11(growth differentiation factor 11，GDF-11)，又称为骨形态发生蛋白-11，属于转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族的一种分泌性蛋白。TGF-β超家族包括转化生长因子(TGF-βs)、骨形态发生蛋白(BMPs)、生长分化因子(GDFs)等亚家族，广泛存在于从线虫到哺乳类动物之中，在机体的免疫调节、细胞生长和分化、细胞外基质的合成和贮存、胚胎发育、创伤修复等方面都发挥着重要的作用。作为TGF-β超家族成员，GDF-11在胚胎发育中也发挥着举足轻重的作用。GDF-11先后在尾芽、肢芽、背根神经节、脊索背侧区、成齿质细胞、嗅上皮、视网膜和脑的特定区域、前肠及后肾间充质中表达，参与中轴骨骼模式图的形成，牙髓细胞的分化，软骨的形成，胰腺的发育，肌细胞的生成及神经再生等过程。新近的研究还发现GDF-11具有明显的抑制甚至逆转心脏、骨骼肌等器官老化，改善大脑认知的作用。

中国专利申请(CN105770860A)公开了生长分化因子-11在促进糖尿病伤口愈合中的用途，属于医药技术领域。本发明通过建立由有效浓度的链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病小鼠伤口模型，评估了生长分化因子-11对糖尿病小鼠伤口模型伤口愈合情况的影响，研究发现生长分化因子-11可以促进糖尿病小鼠伤口的愈合，且其愈合速度均高于阳性对照组(EGF)和空白对照组。因此，本发明的提出为糖尿病伤口愈合治疗提供了一种有效的技术手段。

目前GDF11对于骨髓干细胞成骨方面的影响仍不能确定，但是GDF11对于脂肪来源的间充质干细胞成骨分化的影响尚无报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了GDF11在脂肪间充质干细胞成骨分化中的应用。

所述GDF11可以促进成骨诱导液的成骨能力，也能够单独诱导脂肪间充质干细胞成骨分化。

本发明利用基因工程技术构建pET-22b-gdf11的BL21原核表达菌，其中所用PCR引物为：GDF11-F5'AAAAAGACAGCTATCGCGA 3'为上游引物GDF11-R5'CCCAAGCTTGCCGGATCCTTAAGAGCA 3'为下游引物，上下游引物中分别引入了BamHI和HindIII酶切位点。本发明以人来源的正常细胞的cDNA为模板PCR扩增得到gdf11片段，利用BamHI和Hind III酶对pET-22b质粒以及GDF11 PCR片段经行酶切，连接，转化入大肠杆菌BL21，通过对氨苄抗性的筛选挑出转化成功的单克隆菌，扩大培养后提取质粒，并作为模板进行菌落PCR，在300bp左右有目的条带出现。以及再次使用BamHI和Hind III双酶切出现了一条5000bp以上的条带，为pET-22b(5500bp左右)质粒，还有一条300bp左右的GDF11目的条带。通过测序最终表明构建的pET-22b-gdf11质粒是成功的。

本发明通过发酵生产、镍柱分离纯化，最终得到纯度较高的GDF11蛋白。