[发明专利]一种检测人基因组的竞争性实时荧光PCR SNP探针

说明书

一种检测人基因组的竞争性实时荧光PCR SNP探针，涉及单核苷酸多态性探针。具有二级结构，包含与完全不互补序列且具备水解性的半环状结构以及完全互补序列的荧光探针，在于SNP位于荧光探针的5’端，并且在荧光探针的3’端设计3～5个碱基，使其与荧光探针的5’端结合，从而形成二级结构。另外，在3’端附近外加3～7个不与探针自身互补的碱基。此特殊结构可大大提高水解性，降低荧光本底信号，从而提高实时PCR的灵敏度，增加探针的特异性降低假阳性率。大大提高人体基因组SNP检测的灵敏度及特异性，降低假阳性率，同时又经济简便。

技术领域

本发明涉及单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)探针，尤其是涉及一种检测人基因组的竞争性实时荧光PCR SNP探针。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(Transition)或颠换(Transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C T，在其互补链上则为G A)，也可能是颠换(C A，G T，C G，A T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。Wang等的研究也证明了这一点。转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。

目前，检测SNP的常用方法包括PCR-直接测序法、PCR-焦磷酸测序法、荧光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、PCR-高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性PCR法、PCR-限制性片段长度多态性方法、原位杂交(ISH)等多种方法，每种方法的原理和优缺点如下：

1)PCR-直接测序法

也称PCR-Sanger测序，该方法基于双脱氧核糖核酸(ddNTP)末端终止法，根据核苷酸在某一固定点开始延伸，随机在某一特定碱基处终止，由于掺入的每个碱基都进行了荧光标记，因此产生了以A、T、C、G结束的四组相差一个碱基的不同长度的系列核酸片段；通过毛细管电泳分离这些片段后读取待测核酸的碱基序列。Sanger法测序是DNA序列分析的经典方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准。

PCR-Sanger测序法的操作过程主要包括PCR扩增和PCR产物纯化、测序反应、测序和结果分析四个主要步骤。分析时需要设置阴性对照和阳性质控品。该方法属于定性检测，优点是测序长度较长，可发现新的变异位点。主要不足：灵敏度不高，尤其是在进行肿瘤组织体细胞突变检测时，当组织中靶标基因突变比例低于20％时，可能出现假阴性结果；对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。

2)PCR-焦磷酸测序法