[发明专利]一种研究不同抗氧化剂复合使用在水包油乳状液中相互作用机理的方法

权利要求书

1.一种研究没食子酸酯与α-生育酚在乳状液中的相互作用机理的方法，其特征在于：没食子酸酯分别为没食子酸R0、没食子酸丙酯R3、没食子酸辛酯R8、没食子酸月桂酯R12、没食子酸十八酯R18；

由以下步骤组成：

(1)乳状液的制备：

配制1L 10mM的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液的PH＝7.0，加入0.1g Tween 20，取1w％玉米油溶于99w％PBS缓冲液，高速分散搅拌2min得到粗乳液，用高压均质机在40MPa均质两次得到乳状液，最后加入浓度为0.02％w/v的NaN₃作为抑菌剂；

(2)抗氧化剂相互作用指数的计算

分别取1mmol没食子酸R0、没食子酸丙酯R3、没食子酸辛酯R8、没食子酸月桂酯R12、没食子酸十八酯R18与1mmol的α-生育酚混合溶于100mL的甲醇溶液中，取适量加入乳状液中，使其在乳状液中的最终浓度为30μM，充分搅拌使其混合均匀，取5mL转移至顶空瓶中，密封，25℃避光保存，每天测定乳状液的过氧化值和己醛含量；

A:乳状液过氧化值的测定

Fe²⁺储备液：等体积0.132M BaCl溶液和0.144M FeSO₄·7H₂O溶液混合，离心取上清液，用棕色容量瓶密封保存；Fe³⁺标准贮备溶液：4.9769g FeSO₄·7H₂O溶液溶于50mL去离子水中，加入100mL浓H₂SO₄，加温溶解后滴入20％KMnO₄溶液，直至溶液红色不褪色且保持30s不变，定容至1L，摇匀，储备液每毫升含100μg Fe³⁺，取适量Fe³⁺标准贮备溶液用甲醇：正丁醇的体积比为2:1的混合液定容稀释10倍即得到Fe³⁺标准工作液；

Fe³⁺标准曲线的制作：分别移取0、10、20、40、80、100、200、400μL的Fe³⁺标准工作溶液于10mL试管中，分别加入20μL 3.94M硫氰酸钾溶液，用甲醇：正丁醇的体积比为2:1的混合溶液定容至5mL，涡旋混合10s，室温避光静置20min，甲醇正丁醇混合液作为空白对照，在510nm波长下测定吸光度值，重复三次测定，以吸光度平均值对相应Fe³⁺的含量绘制标准曲线，

乳状液的过氧化值的测定：取1mL乳状液，加入5mL异辛烷：异丙醇的体积比为2:1的混合溶液，涡旋混合，再以5000r/min离心5min，取1mL上清液，加入20μL硫氰酸钾和20μL氯化亚铁溶液，再用甲醇：正丁醇的体积比为2:1的混合溶液定容至5mL，涡旋混合10s，室温下避光静置20min，以甲醇正丁醇混合溶液作空白对照，在510nm波长下测定吸光度值，

计算公式：POV＝(A×n×0.5×K)/(55.86×m×2)×1000

式中：POV为样品的过氧化值，meq/kg；A为测得样品液的吸光度；K为测得Fe³⁺标准曲线的斜率；55.86为Fe的原子量；m样品中油脂的质量，g；0.5为O/Fe的摩尔比；n为吸取上清液的体积分数；2为氧换算为过氧化值的系数，计算结果精确至0.01；

B:乳状液己醛含量的测定

己醛标准曲线的制作：配制含0.001mol己醛的标准液，分别稀释成含己醛0.002，0.005，0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8μmol的梯度标准液，顶空进样GC-MS测定己醛含量，以己醛浓度为横坐标，己醛峰面积为纵坐标做标准曲线；

样品测定：隔天取分装的装有乳状液的顶空瓶进样，

顶空进样条件：炉温65℃；定量环温度110℃；传输线温度130℃；GC平衡时间13min；进样瓶加热平衡时间10min；顶空瓶瓶内压10psi；瓶加压时间0.5min；填充定量环时间0.5min；定量环平衡时间0.5min；进样时间1min，

GC-MS工作条件：色谱柱：Agilent HP-5MS；分流比：7:1；流速1mL/min；柱温65℃；传输线温度280℃；离子源温度230℃；四级杆温度150℃，

C:没食子酸及其烷基酯与α-生育酚的相互作用指数计算

氧化产物从少量被检测到转变成大量产生的拐点对应的时间就是Lag Time，以E表示，相互作用指数Q＝实验测得值/理论期望值＝[E空白-E(A+B)]/{[E空白-EA]+[E空白-EB]}，其中，A和B分别代表没食子酸及其烷基酯和α-生育酚，A+B表示两者复合使用，空白组指不添加抗氧化剂，若Q＝1，没食子酸丙酯与α-生育酚表现为相加作用；Q1，为协同作用，反之，Q1，为拮抗作用；

(3)没食子酸及其烷基酯与α-生育酚复合使用在水相中的分布

取适量乳状液于试管中，分别加入100μM的没食子酸及其烷基酯与α-生育酚的混合溶液，加入200μM EDTA溶液抑制氧化，4℃下15000r/min高速离心1h，取下层乳清再次离心30min，小心吸取下层水液，合并两次水液过0.22 μm有机滤膜，即为待测液；

(4)没食子酸及其烷基酯与α-生育酚复合使用在界面层的分布

取1mL现配的乳状液，加入20μL 30mM的没食子酸及其烷基酯与α-生育酚的混合溶液，涡旋1min，超声处理30min得到含抗氧化剂的乳状液；取10μL0.017M的16-ArN²⁺乙腈溶液与30μL乳状液混合，再与1mL 0.01M的NED乙醇溶液反应，没食子酸及其烷基酯，16-ArN²⁺和NED的终浓度分别为30μM，170μM和0.01M，每隔1min测定反应液在572nm的吸光度值，直至吸光度值不变为止，根据吸光度值随时间的变化得到二级反应速率常数Kobs；

(5)荧光猝灭法分析没食子酸及其烷基酯与α-生育酚的相互作用

制备乳状液，加入50μL 200μM的EDTA溶液抑制氧化，添加α-生育酚甲醇溶液使其终浓度为200μM，室温下振荡混合1h作为储备液；在激发波长295nm条件下扫描得到储备液的荧光光谱；取2-3mL储备液于比色皿中，加入0.1M没食子酸及其烷基酯溶液，每次添加5μL，涡旋混合2min，荧光分光光度计扫描得猝灭光谱，以α-生育酚为荧光剂，没食子酸及其烷基酯为荧光猝灭剂得到激发波长295nm下的荧光光谱，根据Stern-Volmer方程、位点结合模型，获得没食子酸及其烷基酯与α-生育酚结合的结合类型、结合位点数和结合常数，通过这些参数判断乳状液中没食子酸酯与α-生育酚的相互作用情况；

(6)循环伏安法测定没食子酸及其烷基酯、α-生育酚的氧化还原电位

A、B乙腈浓度为2mM，PBS溶液浓度为10mM，Tween20溶液浓度为10mM,Bu₄NPF₆的浓度为0.5M。