[发明专利]一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法

说明书

本发明公开了一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法。本发明前处理方法是在肠道内容物样品中加入去腐剂清洗2遍，再加入去核酸酶溶液清洗，通过冻融法、裂解法对细胞进行裂解，充分释放其中的DNA，最后加入蛋白酶K、SDS和RNA酶去除细胞里面的蛋白质、纤维和RNA，所得产物经常规方法即可得到肠道内容物宏基因组DNA。本发明前处理方法对于杂食性动物的肠道内容物宏基因组DNA的提取有明显的效果，提取的纯度及提取量都能满足PCR扩增、高通量测序等下游实验，具有很强的实用性。

技术领域

本发明属于基因提取技术领域，更具体地说，涉及一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法。

背景技术

鱼肠道微生物在鱼类发育以及健康中起着非常重要的作用，1998年美国科学院第一次提出宏基因组学的概念，通过分析鱼肠道内容物宏基因组能知道鱼类平时的饮食习惯，肠道内益生菌/有害菌以及其他外来入侵菌的组成，从而更好的了解鱼类肠道内环境的平衡以及菌种组成。但由于鱼类在水中环境极为复杂，鱼类的食物来源也多，从而导致在提取过程中出现降解严重或提取不到的情况，最主要是鱼类肠道自身分泌的核酸酶对宏基因组的提取有很大的困难。

目前，对于鱼肠道宏基因组提取的方法有通过粪便试剂盒，基本手提法的方法去提取。但由于存在腐蚀性鱼类这一特殊的鱼种，它们平时的饮食极为复杂，不仅有浮游生物，有海草，还有其他腐类物质，而往往哪些物质是非常容易使提取出来的基因组降解，所以粪便试剂盒在此种鱼类的提取中基本很难提取出适合于宏基因组的研究，而基本手提法也提取不出腐蚀性鱼类的宏基因组。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有方法很难在腐蚀性鱼类的肠道物质中提取到宏基因组DNA等问题，提供一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，该方法处理后再经常规DNA提取步骤，可高效提出完整的肠道内容物宏基因组 DNA。

为了实现上述发明目的，本发明提供一种肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法，其包括如下步骤：

(1)在肠道内容物样品中加入去腐剂清洗2遍、离心去上清；

(2)加入去腐剂和1mM的EDTA溶液清洗；

(3)通过冻融法并加入10mg/ml的溶菌酶对细胞进行裂解；

(4)在65℃下加入蛋白酶K、摩尔质量为10％的SDS去除蛋白质和纤维；

(5)加入终浓度为20mg/ml的RNA酶去除RNA；

其中，所述去腐剂包括0.5M的EDTA、1M的Tris-HCl、0.1M的NaH₂PO₄、 0.1M的Na₂HPO₄和1.5M的NaCl。

作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，所述过滤除菌是使用0.22μm滤膜过滤。

作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述肠道内容物样品为0.3～0.5g。可见，本发明前处理方法仅需少量样品即可完成。

作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述肠道内容物样品为鱼类或人类的前肠道内容物、中肠道内容物和/或后肠道内容物；其中，肠道内容物可包括粪便、泥石、水草、鱼类吞食的水体微生物等。

作为本发明肠道内容物宏基因组DNA提取的前处理方法的一种优选技术方案，步骤(3)中，所述冻融法是-80℃冷冻15min，65℃融解5min；更进一步地，所述冻融法重复3次，使细胞更好的裂解，充分释放其中的DNA。