[发明专利]检测HER2基因突变的特异性引物、液相芯片试剂盒和方法

说明书

本发明提供了一种检测HER2基因突变的液相芯片试剂盒，其包括有：根据HER2基因的各种突变类型及野生型所设计的延伸引物对，所述延伸引物由5’端tag序列和3’端针对目的基因突变位点所设计的特异性引物序列组成，具有不同anti‑tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠；扩增引物。本发明所提供的HER2基因突变检测液相芯片试剂盒可对7种突变型进行联合检测并分型，单次操作即可对96个样本的7个突变位点单独或者同时进行准确分析，检测灵敏度高，其检测结果与测序法结果高度吻合，一致率高达100％，且检测效率远高于常用的测序技术，符合实际应用需求。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学及生物技术，具体的是涉及一种检测HER2基因突变的特异性引物、液相芯片试剂盒和方法。

背景技术

HER2基因，又被称为表皮生长因子受体2(EGFR2)，ERBB-2或NEU，定位于染色体17q21，全长28515bp，转录4624nt的mRNA，编码的蛋白质是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，分子质量约为185ku，长度为1255个氨基酸，前653个氨基酸为胞外区，654-675个氨基酸的区域为穿膜区，676-1255个氨基酸区域为胞内区。

HER2是ERBB受体酪氨酸激酶家族的成员之一，该家族还包括其它3个成员，分别为EGFR(HER1/ERBB1)，HER3(ERBB3)和HER4(ERBB4)，所以HER2与人表皮生长因子受体(EGFR)癌基因有很高的同源序列。配体能与EGFR、HER3、HER4的细胞外结构域结合，诱导这些受体形成同源或异源二聚体，催化激活与细胞增殖、分化和迁移相关的细胞内信号通路级联反应。这些反应是由细胞质信号转换因子如PLC-γ1，Ras-Raf-MEK-MAPKs，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，Src等(信号转导和转录激活因子，STATs)所诱导的。HER2无已知的配体，通常被erbB家族的其它成员通过同型或异型二聚化作用激活。在静止的状态下，这些细胞表面受体以皱褶的单体形式存在，即所谓“关闭状态”，无活性的构象阻止二聚化作用。当配体结合到胞外域时，构象的重排导致其处于“打开状态”，暴露二聚化作用的界面，胞外二聚物结构导致胞内酪氨酸激酶部分受体的反式激活。

HER2突变可以使HER2基因激活，导致酪氨酸激酶结构域构象改变，ATP结合袋缩小，激酶活性增加，受体和下游AKT和MEK通路的激活，从而使多种细胞发生恶性转化或者细胞恶性程度增加，更为有效地激活信号传导、磷酸化EGFR、诱导肿瘤的形成和扩散。研究表明HER2突变(HER2^YVMA)能够诱导不依赖于配体的磷酸根转移，较HER2野生型具有更强能力与介导细胞增殖、能动、生存的信号转换因子关联，HER2^YVMA能够在缺乏ERBB配体以及EGFR激酶活性的情况下激活EGFR。

阿法替尼是EGFR和HER2酪氨酸激酶的强效、不可逆双重抑制剂。研究表明，HER2突变的非小细胞肺癌患者可从药物阿法替尼中获益，HER2基因突变也因有望成为新靶点而备受关注。

截至目前，市场上检测HER2基因突变的试剂盒也非常少，其检测技术主要为荧光定量PCR及高通量测序，荧光定量PCR检测技术无法做到单管多个基因同时检测分型，通量相对较低；高通量测序检测技术设备投资要求高，操作较繁琐，数据较难处理。液相芯片检测技术有一定的优势，设备成本相对较低、特异性强、检测结果准确、可重复性好、通量高等优点。要实现该技术的优势，引物和探针设计、磁珠选择及反应体系优化都是至关重要的。

发明内容