[发明专利]一种耐氧化低温葡萄糖氧化酶及其生产方法与应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种低温葡萄糖氧化酶及其生产方法与应用。所述葡萄糖氧化酶产自黑曲霉(Aspergillu niger)CH870，保藏编号为CGMCC No.14138。该菌株发酵生产的葡萄糖氧化酶的发酵液酶活达到2300U/ml以上，所生产的葡萄糖氧化酶在pH2.0‑8.0范围内稳定，最适反应温度20℃，稳定性好，且具有耐氧化性，30mmol过氧化氢条件下，剩余酶活为100％；200mmol过氧化氢条件下，剩余酶活为90.8％，应用广泛。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种耐氧化性提高的低温葡萄糖氧化酶及其生产方法与应用。

背景技术：

葡萄糖氧化酶(GOD)能够专一地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域都有着广泛的应用。

由于葡萄糖氧化酶能够催化葡萄糖消耗氧气，产生葡萄糖酸和过氧化氢，所以它在食品行业中应用非常广泛，主要表现在以下四个方面：去除食品中残留的葡萄糖、脱氧、杀菌、测定食品中葡萄糖含量。

葡萄糖氧化酶作为新型的绿色酶制剂，在1999年被国家列为12种被允许使用的饲料添加剂之一。葡萄糖氧化酶促生长的作用机理是：在动物饲料中添加的葡萄糖氧化酶能具有抗氧化的功能，能够清除掉牲畜应激状态下在肠道上皮细胞产生的大量自由基，来保护肠道上皮细胞的完整性。

医学上尿糖试纸用来测定糖尿病人尿液中的葡萄糖含量，原理是根据葡萄糖氧化酶酶促反应产生过氧化氢，过氧化氢被过氧化氢酶进一步分解可以产生水和氧，氧将试纸上的还原型并且无色邻联甲苯胺染料氧化为蓝色物质，蓝色物质生成量与葡萄糖浓度成比例，将试纸颜色的深浅与标准色板比较，判断尿中葡萄糖的含量多少。葡萄糖氧化酶氧速率法测定葡萄糖的准确度高、线性范围广、反应特异性强、重复性良好。

目前国际上研制成功的酶传感器有几十种，Updike和Hicks于1967年首次将GOD膜覆盖在铂电极上从而制成酶传感器，它用于定量的检测血清中葡萄糖的含量，并且成功地制成了第一支葡萄糖生物传感器。

葡萄糖氧化酶(GOD)广泛分布于动物、植物及微生物体内。但由于在动植物体内含量较少，并且提取上有一定的局限性，故较少采用。

在微生物中，葡萄糖氧化酶的生产主要采用霉菌发酵法，一般采用曲霉和青霉做为生产菌种，如黑曲霉、米曲霉、青霉、乳酸克鲁维酵母和脆壁克鲁维酵母，是工业生产GOD的普遍酶原。目前，国内外均采用微生物发酵法生产葡萄糖氧化酶。由于霉菌在一定条件下产生葡萄糖氧化酶的能力强，因此，葡萄糖氧化酶的工业化生产主要采用黑曲霉(Aspergillu niger)和青霉菌(Penicilliunnotation)。但葡萄糖氧化酶几乎全部依赖于进口，生产成本也随之提高。因此，筛选性能优越的葡萄糖氧化酶酶，具有重大的实际应用价值。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一种耐氧化低温葡萄糖氧化酶及其生产方法与应用。

所述葡萄糖氧化酶产自一株黑曲霉，所述黑曲霉是本实验室经物理诱变和化学复合诱变后得到一株耐氧化性提高的高产低温葡萄糖氧化酶菌株，经鉴定其属于黑曲霉，具体为黑曲霉(Aspergillu niger)CH870，该菌株已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.14138。

本发明还提供一种发酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的葡萄糖氧化酶的液态微生物发酵生产方法，具体如下：

以黑曲霉(Aspergillu niger)CH870为生产菌种；

(1)种子罐培养：