[发明专利]一种反应‑顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种反应-顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法。

背景技术

赖氨酸是人体必需的氨基酸之一。也是仅有的三种碱性氨基酸之一，常用作食品添加剂和饲料添加剂，高纯度的赖氨酸在医药行业也有应用。目前人工合成赖氨酸主要采用生物发酵法，产品的形式为赖氨酸盐酸盐或者硫酸盐。

赖氨酸的分析方法非常多，如：液相色谱法、高氯酸非水滴定法和甲醛滴定法等。由于色谱法操作复杂，包括氨基酸的柱前衍生化或者柱后衍生化处理，以实现待分析物质能够被荧光光谱或者紫外光谱检测。基于色谱分离的方法，包括高效液相色谱和氨基酸分析仪和阳离子交换树脂法，检测成本高，样品分析时间长。高氯酸非水滴定法使用毒性溶剂，溶剂的排放污染环境。甲醛滴定法以酚酞为指示剂，根据滴定终点碱的消耗量来计算赖氨酸，误差很大。除此之外，茚三酮光谱法广泛用于具有α-氨基基团的氨基酸，如L-赖氨酸，甘氨酸，丙氨酸等的分析检测，其反应原理如图1所示。茚三酮是一种氧化能力强的物质，它氧化氨基酸的α-氨基，自身还原为还原型茚三酮，而氨基酸的氨基氧化为亚氨基，同时分解产生二氧化碳和少一个碳的醛基。在该方法中茚三酮大大过量氨基酸(茚三酮/氨基酸的摩尔比大于30)，它与还原茚三酮，氨水在95°C反应一段时间生成蓝紫色化合物---茚二酮胺。很明显，铵根离子或者有机胺的存在会影响显色物质的生成，带来干扰；另一方面，该显色反应受pH影响很大，不同的pH条件下生成物的颜色差异较大；需要大比例的稀释倍数来满足吸光值能被测试的要求(A低于1.2，测试较为准确)，反应时间的长短也影响颜色的重现性。可见，上述这些不足限制了茚三酮比色法的应用，特别是在一些对精度要求很高的场合。因此，必须探索一种快速、高效的、准确的检验方法，以满足赖氨酸等氨基酸检测的需要。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种反应-顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种反应-顶空气相色谱测定氨基酸含量的方法，包括如下步骤：

(1)标准曲线的绘制：配置一定浓度梯度的氨基酸标准溶液于顶空瓶，然后加入过量的茚三酮溶液，密闭混合均匀后置于顶空气相色谱仪的自动进样托盘，设定50～95℃的温度反应0.5～2h，产生的二氧化碳用气相色谱测量，以二氧化碳信号值(二氧化碳的峰面积)和氨基酸的浓度关系绘制标准曲线；

(2)将氨基酸待测样品溶液稀释至测定范围之内，加入与标准曲线绘制相同量的茚三酮溶液，密闭混合均匀后置于顶空气相色谱仪的自动进样托盘，设定与绘制标准曲线相同的反应温度和时间，产生的二氧化碳用气相色谱测量，所得二氧化碳信号值通过步骤(1)的标准曲线得到相应的氨基酸的浓度，再乘以稀释倍数得到待测样品中氨基酸的浓度。

本发明方法适用于所有能用茚三酮光谱法进行检测的氨基酸。优选地，所述的氨基酸是指赖氨酸或丙氨酸。

优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述反应的温度为60℃，反应时间为1h。过高的反应温度和过长的反应时间会带来茚三酮和中间产物继续反应，产生过量二氧化碳。当二氧化碳产率范围为95％～105％，保证测定的准确性和重现性。

上述方法中，所述过量的茚三酮优选为茚三酮/氨基酸的摩尔比大于15。以保证茚三酮和氨基酸的完全反应，使二氧化碳的产率大于95％。

为了防止缓冲溶液(高温下分解产生二氧化碳)的干扰，优选地，所述氨基酸标准溶液和氨基酸待测样品溶液均用磷酸盐缓冲溶液，茚三酮和氨基酸的反应适宜pH范围较宽，考虑到二氧化碳的快速溢出，pH值为4.2时最优。

优选地，所述茚三酮溶液是指茚三酮的乙醇溶液、乙二醇单甲醚溶液或者乙二醇单乙醚溶液。

优选地，所述气相色谱测量条件如下：热导池检测器(TCD)，载气为氮气，流速为2.7mL/min，压力为30psi，后进样口温度200℃，毛细管柱温105℃，分流比0.1，检测时间3min。

本测定方法的原理为：根据茚三酮和氨基酸的化学反应原理，有定量二氧化碳生成，利用气相色谱检测生成的二氧化碳，从而得出待测样品中氨基酸的浓度。

本发明的方法具有如下优点及有益效果：

(1)本发明检测方法操作简便，精确度高。尤其是克服了茚三酮比色法大比例稀释，反应温度高(95℃)，茚三酮添加量高(相对于氨基酸)及必须冷却等繁琐复杂的步骤。因此，提高了方法的可操作性。