[发明专利]一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型及其制备方法

权利要求书

1.一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型，其特征在于：含有4～6层角膜上皮细胞，采用角膜缘干细胞又不仅限于角膜缘干细胞的角膜系上皮细胞为种子细胞。

2.一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型的制备方法，其特征在于：采用角膜基质层制备基质微粒，结合旋转培养体系体外模拟角膜缘干细胞生长微环境扩增角膜。

3.根据权利要求2所述的一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型的制备方法，其特征在于，采用角膜缘干细胞作为种子细胞，制备角膜上皮细胞体外培养的条件培养基，通过不同的条件培养基诱导角膜缘干细胞体外增殖和分化。

4.根据权利要求3所述的一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型的制备方法，其特征在于，具体方法步骤如下：

1)制备角膜缘干细胞

将来自于眼库的眼球采用含质量分数为1%的庆大霉素的生理盐水浸泡30分钟，将角膜沿角膜缘剪下，得到角膜缘组织；

用D-Hank’s 液漂洗角膜缘组织两只三次；

将清洗好的角膜缘组织剪成2mm见方的组织块，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃消化5～8分钟，采用含有10%胎牛血清的DMED终止消化；

离心，收集细胞；

采用DMEM进行细胞重悬，制成1E4～2E4/ml的角膜缘干细胞细胞悬液，备用；

2)体外培养、扩增角膜缘干细胞

取上述角膜缘干细胞细胞悬液10ml与步骤二中制备的角膜基质微载体200mg注入容量为30ml的旋转培养系统，转速设定为20～30转/分钟，每天采用新鲜的DMEM进行换液，培养至细胞融合度为80%，排干细胞培养液，采用磷酸盐缓冲液清晰一至两遍后，弃去缓冲液，加入0.25%的胰蛋白酶，调整转速至50～70转/分钟，旋转5～10分钟进行细胞收集和获取，完成角膜缘干细胞的体外扩增；

3）构建体外重角膜上皮模型

3.1）将步骤三中获得的角膜缘干细胞采用培养液SK1进行重悬，接种于底面积为0.5cm2的细胞小室中，接种密度为0.2×105～0.5×105个/ cm2，保持该细胞小室内的液量为150～200μl，在5% CO2、36～37℃的细胞培养箱中孵育24～48小时；

本步骤也可以采用角膜缘干细胞和角膜上皮细胞按照1:1或者大于1:1的比例混合进行；

所述构建培养液SKc1是在DMEM培养液中添加体积比分别为5～10%的胎牛血清FBS，0.1～0.5ng/ml 的EGF，0.1～0.8 μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰岛素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0.5nM的ThyroxineT3,4～10μg/ml的维甲酸；

3.2）培养2～3d后，更换成构建培养液SK2，并进行气液面培养，将步骤4.1）中细胞小室内的培养液吸去，保持构建模型面表的干燥，随后在4.5%～5.5% CO2、37±1℃的孵箱中培养2～3d，每天换液一次；所述构建培养液SK2是在DMEM培养液中添加体积比分别为5～10%的胎牛血清FBS，添加0.25～0.5 mM的CaCl2，0.1～0. 5 ng/ml 的EGF，25～75μg/ml的Vc，0.1～0.8 μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰岛素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0.5nM的ThyroxineT3，4～10μg/ml的维甲酸；

3.3）2～3d后，更换成构建培养液SK3，并进行气液面培养，在4.5%～5.5% CO2、37±1℃的孵箱中培养2～3d，每天换液一次；所述构建培养液SK3是在DMEM培养液中添加体积比分别为5～10%的胎牛血清FBS，添加0.5～1mM的CaCl2，0.1～0. 5 ng/ml 的EGF，25～75μg/ml的Vc，0.1～0.8μg/ml的地塞米松，3～25μg/L的胰岛素INSULIN，15～45μg/ml的腺嘌呤，0.1～0. 5nM的ThyroxineT3，4～10μg/ml的维甲酸。