[发明专利]一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型及其制备方法在审

专利信息
申请号: 201710841289.3 申请日: 2018-01-22
公开(公告)号: CN110066847A 公开(公告)日: 2019-07-30
发明(设计)人: 李潇;卢永波;邓志宏 申请(专利权)人: 广东博溪生物科技有限公司
主分类号: C12Q1/02 分类号: C12Q1/02;C12N5/074;A61L27/38;A61L27/50;A61F2/14
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地址: 523808 广东省东莞市松山湖高新技术产业开*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 眼表 角膜模型 种子细胞 制备 角膜缘干细胞 体外器官培养 角膜上皮 体外富集 组织再生 产业化 刺激体 眼刺激 构建 角膜 扩增 体外 三维 体内 替代 推行 保证
【说明书】:

一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型及其制备方法,具体涉及体外器官培养与组织再生领域。本发明从种子细胞角度出发,通过体外富集和扩增角膜缘干细胞进行三维角膜上皮模型的构建,既实现了种子细胞为角膜系,保证了眼刺激评价的体外体内一致性,也解决了产业化大规模生产问题,有利于眼表刺激体外替代实验的推行。

技术领域

一种用于眼表刺激性评价的重组角膜模型及其制备方法,具体涉及体外器官培养与组织再生领域。

背景技术

近年来,随着体外器官培养技术的发展,基于体外细胞培养构建的3D重组角膜模型,在临床替代损伤角膜结构,进行眼角膜损伤性修复的治疗方面具有显著功效。但由于其临床目应用主要是替代角膜损伤组织进行进行移植,多以开放式片状形式生产,并且是生物材料和不同类型种子细胞体外复合形成的三维空间复合体,因此整个角膜组织的结构及通透性方面都发生了改变,而化学品眼刺激性评价需要模仿化学品在眼表的渗透过程,要求在边缘无渗漏的密闭体系下进行,且应用于评价的重组角膜模型需要形成紧密的细胞连接才能体外模仿化学品在人体眼表的渗透特性,而给出准确的刺激性评价结果。因此,当前临床上应用的重组角膜无法进行化学品的眼刺激性体外替代评价。

基于以上背景,建立和开发类似于人体角膜上皮的细胞三维结构,不仅可以更为真实的反映人体对化学物的响应,准确给出化学物刺激性的预测,对于化合物筛选的种类也具有更宽的应用范畴,除了不同功效目的的剂型开发,也包括化妆品具体成分的危害评价。目前,国际上针对化学品眼刺激性评价的体外重组角膜上皮模型主要有三种商业化的产品, EpiOcular™ (MatTek, MA, USA), HCE (Skin Ethic ,France)以及CORNEA-MODEL(Labcyte,Japen)。其中EpiOcularTM以人源的皮肤角质形成细胞作为种子细胞,体外培养形成类似于角膜上皮结构的模型。HCE模型采用永生化的角膜上皮细胞系作为种子细胞进行培养形成的多细胞层的角膜上皮组织类似物,结构上和角膜黏膜非常类似。虽然两款模型在眼刺激性动物替代评价方法中扮演重要的角色,但是EpiOcular的非角膜细胞系和HCE模型的永生化细胞系并不能完全意义上等同于人角膜,因此,对于体外模拟化学物对角膜刺激性的精确复制还有待考量。Labcyte CORNEA-MODEL采用正常的人角膜上皮细胞系进行构建,体外培养形成角膜上皮结构。角膜上皮细胞是体外研究细胞分化,信号传导、细胞稳态信号通路的模式工具,也可以用来进行体外三维的角膜上皮组织模型,但是可用角膜组织的有限来源,角膜细胞自身短暂的生命周期以及快速的分化使得角膜上皮细胞体外培养难度大,且非常耗时。因此,采用角膜上皮细胞进行三维角膜模型的体外构建如果不解决种子细胞自身的问题,将仅限于实验室培养,而无法进行产业化,许多尝试增长角膜上皮细胞体外培养周期的工作都有开展,例如病毒转染,端粒酶逆转录基因转染等,但是这些永生化的细胞系因为其异常的基因表型和致瘤的潜在风险而无法应用于生物学中角膜模型的构建。

发明内容

本发明从种子细胞角度出发,通过体外富集和扩增角膜缘干细胞进行三维角膜上皮模型的构建,既实现了种子细胞为角膜系,保证了眼刺激评价的体外体内一致性,也解决了产业化大规模生产问题,有利于眼表刺激体外替代实验的推行。因此,本发明旨在提供一种可在体外模拟实现角膜缘干细胞培养、扩增及用其构建三维角膜上皮模型的方法。此外本发明也提供一种可用于体外模拟角膜缘干细胞微环境的角膜基质微粒的制备方法。

解决上述问题,采用的技术方案如下:

一、制备脱细胞角膜基质

选取包含有前弹力层的动物源性角膜,将其置于添加抗生素的、温度在2~30℃的去离子水中浸泡,对其进行脱细胞处理,具体方法可参考专利CN 104971384 A中的方法。将获取的脱细胞动物源性的角膜材料置于削切机中,切削获取角膜基质层。并对角膜基质层进行去抗原、病毒灭活处理。

二、 制备角膜基质微载体

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