[发明专利]一种核酸测定方法

说明书

本发明涉及一种核酸测定方法，该方法通过可封闭的反应容器实施，反应容器包括管状腔室以及连通管状腔室的通道；其中，第一个管状腔室内设置有样品和第一反应试剂；第n个管状腔室内设置有第n反应试剂；该方法包括：将反应容器封闭，在第一个管状腔室中进行第一组反应，第一个管状腔室中的产物通过通道传送到后一个管状腔室；前一个管状腔室的产物传送到第n个管状腔室后，在第n个管状腔室中进行第n组反应。本发明提供的核酸测定方法能够保证封闭性并且操作便捷简单。且无需使用分子探针，不依赖聚合酶外切活性并且不受靶分子长度限制。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种核酸定性或定量测定的方法。

背景技术

随着生物技术的发展，现代分子生物学技术或基因工程技术正被日益广泛地用到各种生物技术产业中，特别是应用到医疗诊断中。这类技术的应用，往往涉及用分子探针进行定性、定量测定。典型的核酸定量扩增反应是聚合酶链式反应，即PCR。例如，当对RNA病毒进行检测和诊断时，首先需对病毒RNA进行纯化，再将RNA进行逆转录（RT）成cDNA，然后进行cDNA定量扩增反应 （RT-PCR）。可见RT-PCR是两步反应。多步反应还包括巢式PCR (nestedPCR) 。巢式PCR是用一对外引物完成第一步PCR后、再用一对内引物对第一步反应的产物进行第二步反应并进行定量测定。多重PCR是在一反应体系(反应管)内含有多对引物。巢式PCR的多步反应可以与多重PCR相结合、即在巢式PCR的第一步进行多重PCR、巢式PCR的第二步分别进行多个单重定量PCR。

其中，定量PCR是在DNA扩增反应中，检测每次聚合酶链反应循环后产物总量，以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。

巢式PCR使用两对或两对以上的PCR引物分别进行扩增反应。第一对PCR引物称外引物(对)、第二对引物称内引物(对)。由于内引物结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增产物。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR具有非常有高的特异性和灵敏度。

多重PCR是在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR能够在同一PCR反应体系中对多个基因进行分析，具有高效性。

RNA单链分子可通过逆转录酶转录(RT)成为互补的DNA或称cDNA分子。cDNA可与普通DNA一样可用于PCR反应。这一过程叫做RT-PCR。

上述多种PCR反应可以单独实施，也可以多种PCR反应相互结合。现有技术常常采用多个反应器分别进行多步反应，不能满足密封的要求，特别是在产品转移的过程中，产物容易造成污染。

此外，现有技术中常用实时荧光定量核酸扩增检测对核酸进行定量检测，检测时需要用到荧光标记的分子探针。现有用探针进行定量的方法的缺点是探针需要有二至三个标记物，在设计、制作上成本高。该方法还需要使用具外切酶活性的聚合酶，对试剂的要求高。现有用探针进行定量的方法还要求靶分子有足够的长度，如五十碱基对以上。以上要求在许多应用情况不能被满足。

现有技术中也存在使用非专一性的荧光染料对核酸进行定量测定等方法。这类荧光染料可与双链的DNA结合并产生荧光，产生的信号与DNA量成正比，但与DNA的序列无关，无法测出DNA中的特定序列。

发明内容

为了解决上述的问题，本发明的目的是提供一种保证封闭性并且操作便捷简单的核酸测定方法。

进一步地，本发明的目的是提供无探针的、不依赖聚合酶外切活性并且不受靶分子长度限制的核酸定性或定量测定方法。