[发明专利]一株马乳酒样乳杆菌ZW3菌株及其分子检测方法

说明书

一株马乳酒样乳杆菌ZW3菌株及其分子检测方法。本方法在结合镜检观察形态学特征和16SrDNA鉴定的基础上，运用多位点序列分型(MLST)方法，将马乳酒样乳杆菌ZW3的全基因组序列作为参考基因组，以7个管家基因为目标基因，设计特异性引物，用于确定ZW3的生物遗传信息标签，进行马乳酒样乳杆菌不同菌株的识别。通过实验证明，基于这7个管家基因的标签可以从其他乳杆菌菌株中快速准确的鉴定出马乳酒样乳杆菌ZW3菌株。因此，所述的分子检测方法以及提供的特异性引物序列，可以用于马乳酒样乳杆菌在发酵乳、发酵果蔬、发酵植物蛋白、发酵肉制品、菌粉等发酵食品和药品方面的检测。

所属技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及乳酸菌的多位点序列分型基因以及利用该序列鉴定其品种的方法。

背景技术

乳酸菌是维持肠道菌群平衡的有益菌群之一，其益生作用与其代谢产物密切相关。马乳酒样乳杆菌作为一种乳酸菌，具有广泛的应用价值。但是，由于乳酸菌的功能具有菌株特异性，精确的菌株识别是益生菌使用的必要前提。传统的生理生化实验耗时长、花费高、准确率低，重要的是不能精确鉴定到菌株的水平。

发明内容

为了快速准确地从复杂的含有乳酸菌的产品中鉴别出ZW3菌株，本发明提供了一种新的马乳酒样乳杆菌ZW3的分子检测方法及特异性引物序列。

本发明所述产胞外多糖及调节肠道菌群平衡的菌株ZW3为已经过全基因组测序确定为乳杆菌属中的一种：即马乳酒样乳杆菌，GenBank序列号为CP002764。该菌株已于2008年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号CGMCC 2809，建议分类命名为马乳酒样乳杆菌马乳酒亚种Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciens。

相比传统生理生化鉴定和16SrDNA鉴定方法，多位点序列分型(MLST)简单便捷、准确性好、特异性高，可作为菌株的生物标签。所以利用MLST方法快速准确的鉴定乳酸菌十分必要。管家基因通常主要编码代谢功能相关蛋白，普遍存在于每种微生物中。有研究已知，不同种属的菌株在管家基因的遗传方面有着不同程度的差异。通过分析已报道的乳酸菌多位点序列分型常用基因，将马乳酒样乳杆菌ZW3的全基因组序列作为参考基因组，筛选出在乳杆菌中具有较好保守性、在不同种间又具有差异性的7个管家基因为目标基因，比对序列后找出序列两端相对保守的区域设计特异性引物，确定了ZW3的生物遗传信息标签。扩增长度在374-675bp之间，符合多位点序列分型实验设计要求且选取的7个管家基因组合可以保证绝大多数被鉴定菌株的准确性。所选取的七个管家基因基因序列为：rpoA、Hsp60、LeuS、rpsB、glyK、pyrG和fusA。通过实验证明，该标签可以从其他乳酸菌菌株之中，快速准确的鉴定出马乳酒样乳杆菌ZW3菌株。

本发明提供的快速鉴定马乳酒样乳杆菌ZW3的分子检测方法，在结合镜检观察形态学特征和16SrDNA鉴定的基础上主要运用MLST方法，设计特异性引物序列进行PCR，用于识别马乳酒样乳杆菌ZW3；具体包括如下步骤：

(1)形态学观察待测菌株。

(2)提取待测菌株的基因组DNA。

(3)以步骤(2)中提取得到的基因组DNA为模版，利用通用引物扩增待测菌株的16SrDNA基因，并进行序列比对。

16SrDNA序列扩增50.0μL反应体系为：1.0μLDNA模板，25.0μL 2×Taq PCRMix，1.0μLForwardprimer(10μΜ)，1.0μL Reverse primer(10μΜ)，22.0μL ddH₂O；。反应程序是：95℃预变性8min；95℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。