[发明专利]一种定量检测血液循环微粒浓度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液成分计量分析技术领域，尤其涉及一种定量检测血液循环微粒浓度的方法。

背景技术

血液中微粒是由血液细胞、血管内皮细胞、血小板等在受到刺激活化后形成的，能直接而特异性地反映其来源细胞的功能状态，为揭示血液或血管性疾病及与血管相关的疾病的发病机制、发展趋势提供依据，也可作为鉴别诊断、临床疗效的指征之一，因而检测血液中微粒具有重要意义。

现有技术中，血液中循环微粒检测通常将待测血液使用高速离心后经荧光标记进行流式细胞技术。然而离心过程会造成循环微粒的破坏、融合，也会造成更多的微粒吸附在沉降的血细胞表面，导致循环微粒的表型改变以及循环微粒定量减低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量检测血液循环微粒浓度的方法。本发明提供的检测方法避免了离心对微粒定量的影响，减少了红细胞和白细胞对流式细胞技术定量微粒的误差，避免了使用昂贵计数微球，更易于在临床普及。

本发明提供了一种用于循环微粒检测的血液样品的前处理方法，包括以下步骤：

采用缓冲液将血液进行稀释后采用5μm滤膜进行过滤；

将所述过滤后血液中的微粒进行抗体染色，得到待测样品；

所述染色为：采用AnnexinV抗体对微粒进行染色。

优选的是，所述稀释用缓冲液包括PBS、0.9％氯化钠等渗溶液中的一种。

优选的是，所述稀释的倍数为5～100倍体积。

优选的是，所述滤膜的材质为聚苯烯。

优选的是，所述过滤的速度为10～100ul/s。

优选的是，所述抗体染色后，避光孵育25～30min。

本发明还提供了一种定量检测血液循环微粒浓度的方法，包括以下步骤：

采用流式细胞仪检测上述技术方案所述前处理方法得到的待测样品中微粒和血小板的比例；

采用血细胞计数仪检测所述待测样品中血小板的浓度，根据所述微粒和血小板的比例以及血小板的浓度得到微粒的浓度。

本发明提供了一种用于循环微粒检测的血液样品的前处理方法。前处理方法中的稀释和过滤操作实现了红细胞、白细胞和细胞碎片的去除，避免了离心对微粒定量的影响，以及红细胞和白细胞对流式细胞技术定量微粒的误差，操作简单且检测准确度高。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的定量检测血液循环微粒浓度的操作示意图；

图2为本发明实施例1提供的高灵敏度流式细胞仪对微粒、血小板以及红细胞和白细胞区域设置检测图，其中图2-1为高灵敏度流式细胞仪对微粒、血小板以及红细胞和白细胞区域设置检测图，图2-2为使用Biocytex公司的Megamix-SSC荧光微球对微粒区域设置的检测图；

图3为本发明实施例1提供的高灵敏度流式细胞仪定量检测过滤后血液样本的检测图，其中图3-1为高灵敏度流式细胞仪定量检测过滤后血液样本中微粒、血小板以及红细胞和白细胞区域设置检测图，图3-2为高灵敏度流式细胞仪定量检测过滤后血液样本中AnnexinV+微粒检测图；

图4为本发明实施例1提供的高灵敏度流式细胞仪血浆样本的检测图，其中图4-1为高灵敏度流式细胞仪定量检测血浆样本中使用Biocytex公司的Megamix-SSC荧光微球对微粒区域设置的检测图，图4-2为高灵敏度流式细胞仪定量检测血浆样本中AnnexinV+微粒的检测图；

图5为本发明实施例1提供的高灵敏度流式细胞仪定量检测全血样本的检测图，其中图5-1为高灵敏度流式细胞仪定量检测全血样本中微粒、血小板以及红细胞和白细胞区域设置检测图，图5-2为高灵敏度流式细胞仪定量检测全血样本中AnnexinV+微粒检测图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于循环微粒检测的血液样品的前处理方法，包括以下步骤：

采用缓冲液将血液进行稀释后采用5μm滤膜进行过滤；

将所述过滤后血液中的微粒进行抗体染色，得到待测样品；

所述染色为：采用AnnexinV抗体对微粒进行染色。

本发明采用缓冲液将血液进行稀释后采用5μm滤膜进行过滤。本发明对所述血液没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的检测用血液样品即可，如使用大规格采血针(≥21G)收集血液，舍弃初始收集的1～3毫升血液，加入抗凝剂，在5min内对血液样品进行处理。本发明对所述抗凝剂没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的市售抗凝剂即可，如柠檬酸钠。