[发明专利]环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为60-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子抗原表位的单克隆抗体细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子检测试剂盒，其特征在于所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是90-110nm；所述稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素。

3.根据权利要求2所述的一种环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子检测试剂盒，其特征在于所述稀土荧光微球掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

4.根据权利要求1所述的一种环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子质检测试剂盒，其特征在于所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于200mM Tris-HCL处理液中，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时后制得。

5.根据权利要求4所述的一种环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子质检测试剂盒，其特征在于结合垫上的所述稀土荧光微球标记的环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子单克隆抗体采用如下步骤制得：

步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成20个氨基酸左右的多肽序列，交联到KLH上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株，将所获得的细胞株对应的单克隆抗体进行配对实验和亲和力测定实验，根据实验结果确定捕获抗体和检测抗体；

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化用于检测的环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤3：稀土荧光微球的醛基化：取3mg稀土荧光微球，用50mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入300μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

步骤4：稀土荧光微球标记的环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子单克隆抗体的制备：将2mg用于检测的环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度10mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液(100mM Tris-HCL，pH7.5，含2％BSA，5％蔗糖)，4℃封闭过夜；然后用100mM Tris-HCL，pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的100mM Tris-HCL缓冲液中，4℃避光保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子质检测试剂盒，其特征在于所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得：

步骤1：根据前述配对实验和亲和力测定实验，选择用于捕获的抗体对应的单克隆抗体细胞株，按照标准的腹水生产工艺制备并纯化用于捕获的环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子单克隆抗体，保存于-20℃备用；

步骤2：分别用包被稀释液将环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

7.根据权利要求1所述的一种环瓜氨酸肽抗体和类风湿因子质检测试剂盒，其特征在于所述样品垫通过以下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于含有2.0％Triton X-100，2％BSA，0.1M Tris缓冲液，pH7.5的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。