[发明专利]用于检测血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用

权利要求书

1.用于连接标记有不同荧光染料磁性微球的DNA探针组，其特征为：

（1）产气肠杆菌1型、2型、3型、5型、6型、7型和8型的wzy基因中分别选取的一种DNA片段和

（2）产气肠杆菌4型的orf8基因中选取的一种DNA片段；

上述DNA片段为SEQ ID NO: 1-8所示，具体序列如下：SEQ ID (5'-3')

NO: 1 GATGGCTTCAAATCAAGTAGT选取自产气肠杆菌1型的wzy基因，用于检测产气肠杆菌1型；

NO: 2 AGCACTATACATACCGATTAAA选取自产气肠杆菌2型的wzy基因，用于检测产气肠杆菌2型；

NO: 3 GCTATTACCAAATGCGAGTAG选取自产气肠杆菌3型的wzy基因，用于检测产气肠杆菌3型；

NO: 4 ACTGGGATACATGGTTGCG选取自产气肠杆菌4型的orf8基因，用于检测产气肠杆菌4型；

NO: 5 ATACGCAGCATTTAAGAGAGA 选取自产气肠杆菌5型的wzy基因，用于检测产气肠杆菌5型；

NO: 6 AAGGTTCAGTTGGGTTACGC选取自产气肠杆菌6型的wzy基因，用于检测产气肠杆菌6型；

NO: 7 ACCAGGTTTGGCAAGACA选取自产气肠杆菌7型的wzy基因，用于检测产气肠杆菌7型；

NO: 8 TTTCGTGGGACAAACGTAGA选取自产气肠杆菌8型的wzy基因，用于检测产气肠杆菌8型。

2.权利要求1所述用于连接标记有不同荧光染料磁性微球的DNA探针组在制备用于检测产气肠杆菌1-8型中至少一种血清型悬液芯片方面的应用。

3.含有权利要求1所述的用于连接标记有不同荧光染料磁性微球的DNA探针组的悬液芯片制备方法，主要包含以下步骤：

（1）在产气肠杆菌1-3型和5-8型的wzy基因内部，以及产气肠杆菌4型的orf8基因内部制备用于多重PCR的DNA引物，每个血清型的引物包含上、下游引物各1条，且下游引物利用生物素基团进行标记；

（2）在产气肠杆菌1-3型和5-8型的wzy基因内部，以及产气肠杆菌4型的orf8基因内部制备权利要求1所述的DNA探针组，每个血清型的DNA探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条DNA探针在5'末端均加入12个碳原子作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的标记有荧光染料的磁性微球进行偶联；

（3）利用步骤（2）的DNA探针与不同荧光染料磁性微球进行偶联；

（4）制备待检测样品的基因组DNA，利用步骤（1）制备的引物，进行多重PCR扩增；

（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的DNA探针进行杂交和染色；

（6）将步骤（5）获得的染色后的杂交产物利用Bio-Plex 200悬液芯片系统进行检测；

其中，步骤（1）所述的DNA引物包括SEQ ID NO: 9-24所示的DNA序列，各条序列(5'-3')如下：

P1 （SEQ ID NO: 9）TTGATTACTGGCGTTGGC 扩增产气肠杆菌1型wzy基因的上游引物；

P2 （SEQ ID NO: 10）TTCACCCACAGACTGTTCC 扩增产气肠杆菌1型wzy基因的下游引物；

P3 （SEQ ID NO: 11）TTGTTCTGGAATCTGGGTT 扩增产气肠杆菌2型wzy基因的上游引物；

P4 （SEQ ID NO: 12）CGCATCTTGAAGGGTTGTA 扩增产气肠杆菌2型wzy基因的下游引物；

P5 （SEQ ID NO: 13）TTTGGTCGTACTGGTTAGG 扩增产气肠杆菌3型wzy基因的上游引物；

P6 （SEQ ID NO: 14）AATCCCACCATTCAAACG 扩增产气肠杆菌3型wzy基因的下游引物；

P7 （SEQ ID NO: 15）ATAGAGACGGTAAAGAAAGTAA 扩增产气肠杆菌4型orf8基因的上游引物；

P8 （SEQ ID NO: 16）TCCCGATTTCTGTCCTTC 扩增产气肠杆菌4型orf8基因的下游引物；

P9 （SEQ ID NO: 17）ATACTGGTGAGATGGAGGAA 扩增产气肠杆菌5型wzy基因的上游引物；

P10 （SEQ ID NO: 18）CCCGCCATTTAGTCTTCC 扩增产气肠杆菌5型wzy基因的下游引物；

P11 （SEQ ID NO: 19）TTTCATCGCCCATTACCT 扩增产气肠杆菌6型wzy基因的上游引物；

P12 （SEQ ID NO: 20）TTGAACAGCCAAGGAAAT 扩增产气肠杆菌6型wzy基因的下游引物；

P13 （SEQ ID NO: 21）TTATTTGTTGGACTGGCTAT 扩增产气肠杆菌7型wzy基因的上游引物；

P14 （SEQ ID NO: 22）CAGGCGAATCAATAAAGG 扩增产气肠杆菌7型wzy基因的下游引物；

P15 （SEQ ID NO: 23）TTCAGGCTTGGGAATAGA 扩增产气肠杆菌8型wzy基因的上游引物；

P16 （SEQ ID NO: 24）TGAGGCTTGCTATTCTACG 扩增产气肠杆菌8型wzy基因的下游引物。