[发明专利]用于检测血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用

说明书

本发明提供了用于检测产气肠杆菌血清型1‑8型的特异寡核苷酸序列，该寡核苷酸包括：（1）产气肠杆菌1型、2型、3型、5型、6型、7型和8型的wzy基因中选取的一种DNA片段；（2）产气肠杆菌4型的orf8基因中选取的一种DNA片段。本发明结合Bio‑Rad公司的Bio‑Plex 200悬液芯片系统，建立了一套用于检测产气肠杆菌血清型1‑8型的悬液芯片检测系统及其检测方法，填补了关于产气肠杆菌的血清学分型技术的空白，对于这一重要致病菌的临床检测和流行病学监测具有重要意义。

技术领域

本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于我国常见血清型产气肠杆菌分型的悬液芯片及应用。

背景技术

血清学分型自上世纪30年代开始被广泛使用，至今已有超过80年的历史，可在种/属内将细菌进一步分类，是一种重要的细菌鉴定方法，目前，血清学鉴定方法是使用最为普遍的致病菌鉴定和溯源方法。例如：我国针对志贺氏菌（GB/T 4789.5-2012）、致泻性大肠肝菌（GB/T 4789.6-2003）、大肠肝菌O157：H7（GB/T 4789.36-2008）、副溶血狐菌（GB/T4789.7-2013）、沙门氏菌（GB/T 4789.4-2010）和小肠结肠耶尔森菌（GB/T 4789.8-2008）等致病菌检验的国家标准中均采用了血清学鉴定的方法。血清学鉴定主要是基于细菌表面多糖抗原和鞭毛抗原的免疫原性进行。表面抗原位于细菌最外层，长期受到宿主免疫系统和其它环境因素的强大选择压力，而细菌表面抗原在这一压力下形成的高度多样性也为细菌的血清学分型提供了重要基础。

传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：

1）建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长，例如：建立一个较为全面的大肠杆菌血清学分型系统经历了30余年的时间（约1944-1977)；因此，一些重要致病菌的血清学分型系统尚未建立，给这些致病菌的鉴定、监测和溯源工作带来了巨大困难；

2）抗血清的生产和质控较为困难，为了避免交叉反应，抗血清生产中需进行大量吸附反应；

3）很多抗血清国际上只有少数几家单位生产和保存，且用于鉴定的抗血清严重不全，国际上生产细菌抗血清的主要公司美国的Difco公司、日本的Denka Seiken公司、泰国SA公司等提供不到实际需要种类的20%；4）血清学鉴定的实验过程耗时较长，以沙门氏菌为例，自获得纯培养物至完成血清型鉴定需要2-6天。上述缺陷严重限制了致病菌早期诊断的效率，为传染病的流行和暴发埋下了隐患。

建立与传统血清学方法相对应的高通量分子甄别技术，不但可大幅度提高细菌血清型鉴定的速度、准确性和通量，而且可使基于传统血清学鉴定和分子生物学鉴定的各种流行病学数据之间能够有效整合、协调，并可让使用不同细菌鉴定技术的实验室之间能够进行数据交流，从而有利于传染病多层次防控体系的建立。悬液芯片是芯片技术与流式细胞术相结合的新技术。即将DNA、抗体等附着于微球表面作为探针，在悬液中与待测物结合，再加入荧光标记的报道分子，借助流式细胞仪检测微球表面荧光标记物。除了具有高通量、特异性高和灵敏度高等特点外，与传统的固相芯片比较，其还具有信号收集和处理快速、操作简便、成本相对低廉等特点。近年来，随着悬液芯片技术的逐渐成熟，其正逐步用于科研和多个分子生物学诊断实验室，并逐渐商业化，显示了较好的应用前景。