[发明专利]一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的应用

权利要求书

1.一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)细胞培养：从液氮中取出人白血病THP-1细胞冻存管，放入37℃水浴锅中迅速融化，将细胞吸出放入离心管中，1000rpm/min离心5min，倒掉上清，将人白血病细胞株THP-1悬浮于含有灭活胎牛血清的无菌DMEM培养液中，置于浓度为5％CO₂、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养，细胞长至培养瓶底面积的70％～80％传代1次；

(2)药物配制：Ara-C用无菌DMEM培养基溶解，oTR用0.1％DMSO溶解，继续用无菌DMEM培养基将溶解好的Ara-C和oTR稀释至浓度为1μM-300μM；拮抗剂用DMSO溶解至浓度为5mM；过滤除菌，室温保存；所述的拮抗剂包括两类，分别为腺苷受体拮抗剂和核苷转运体拮抗剂，腺苷受体拮抗剂包括DPCPX、SCH58261、MRS1754和MRS1191；核苷转运体拮抗剂为Dipyridamole；

(3)检测细胞形态学变化：将处于对数生长期的5×10⁵～1×10⁶个细胞接种于每孔含有3ml DMEM培养液的6孔板中，设置3组实验，每组两个复孔；分别是：第1组：空白对照组；第2组：0.3μM oTR组；第3组：1.5μM oTR组；置于浓度为5％CO₂、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育3-5天，光学倒置显微镜下观察细胞形态；

(4)药物处理细胞：收集对数生长期的THP-1细胞，用血球计数板进行细胞计数，按照5×10⁴/ml密度稀释细胞，加入含10％FBS的DMEM培养基，每孔100μl细胞悬液接种于96孔板中；设置9组实验组及1组对照组，每组5个复孔，分别是：第1组：空白对照组；第2组：0.1％DMSO组；第3组：0.3μΜ oTR组；第4组：1.5μΜ oTR组；第5组：15μΜ oTR组；第6组：30μΜoTR组；第7组：0.3μΜ Ara-C组；第8组：1.5μΜ Ara-C组；第9组：15μΜ Ara-C组；第10组：30μΜ Ara-C组；置于浓度为5％CO₂、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育4天；台盼蓝染色检测活细胞/死细胞，向细胞悬液中加入0.4％台盼蓝溶液，使台盼蓝终浓度为0.04％，在三分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，记录数据；

(5)检测拮抗剂对oTR作用的影响：将处于对数生长期的5×10³～5×10⁴个细胞接种于每孔含有100μl DMEM培养液的96孔板中，设置5组实验，分别为：第1组：DPCPX组；第2组：SCH58261组；第3组：MRS1754组；第4组：MRS1191组；第5组：Dipyridamole组；每组再设空白对照组、拮抗剂单独作用组、1.5μM oTR处理组以及拮抗剂与oTR联合作用组，各5个复孔；拮抗剂的工作浓度为5μM，拮抗剂与oTR联合作用组中oTR的工作浓度为1.5μM；置于浓度为5％CO₂、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养4天；采用CCK-8试剂盒进行检测，每孔细胞悬液中加10μl CCK-8溶液，置于37℃，CO₂培养箱中孵育2h，测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据。