[发明专利]一种检测普氏立克次体的RPA方法、其专用引物和探针及用途

权利要求书

1.一种用于检测普氏立克次体的RPA专用引物，是根据普氏立克次体特异性保守序列设计的，所述普氏立克次体特异性保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，

SEQ ID NO.1：

AAACAGGAAATTAATTCTATTAATAGTTTAGATTCAGCAGTTCTTGTAGAATCACAACAGTTTAAAAAAACTAAAAGTCTAGAAGATATAGAAGATGGATCTTTATCATCACAATTAAAGCAAACTAAATATAAATCGGTGTTATCACCTTCTTCTTATGTTAACGACATGTTTAGTAATGAGCATCATCAAAACTCTAGCATTGAACTACCAAAGTTGTTGCATAGTTCATTGAGTGATACGAACAGTTCGCTTAATGATTGTATAAATCAACTACGATGTGCAAATACATCAGATGTATATAATTTATCATATACACTTTCAAATAAAACAAAGCAATTAAGTATTGATGAACTCAAAAATACATTAGAACAAATGCAAACTTCTCCTAATATAAATATAGTATTGCCTATGCTAATTAGAGTACAACAAGATTATGTAAATGAGGTTGCTGAAATATACCAGCAGACTATAGAACAAAGAAAGCAAAACCCAAGTGAGCAGGCAAAAAATCAAGAAGAGGTAGTAGCAGCTTACTTTACTCAAGAATACGATAAACTA ；

所述引物中的正向引物具有SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸序列，反向引物具有SEQ IDNO.3所示的寡核苷酸序列，且5’端标记生物素（Biotin），

SEQ ID NO.2：5’ TTAATAGTTTAGATTCAGCAGTTCTTGTAG 3’

SEQ ID NO.3：5’ GTTCGTATCACTCAATGAACTATGCAACAA 3’。

2.一种用于检测普氏立克次体的RPA探针，是根据普氏立克次体特异性保守序列设计的，所述普氏立克次体特异性保守序列具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；该探针具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列，且5’端标记荧光素，3’端添加延伸阻断基团，在第30-31位碱基之间增加一个四氢呋喃（THF）；

SEQ ID NO.4：

5’ GTTTAGTAATGAGCATCATCAAAACTCTAGATTGAACTACCAAAG 3’ 。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述探针由荧光素、5’端序列、四氢呋喃（THF）、3’端序列及3’端延伸阻断基团组成。

4.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：所述的荧光素为羧基荧光素FAM或FITC等其他荧光素，所述的延伸阻断基团为磷酸基团或其他阻断基团。

5.根据权利要求2所述的探针，其特征在于：长度为45bp，其中5’端30bp，3’端15bp。

6.权利要求1的引物和/或权利要求2-5任一的探针，在制备普式立克次体RPA检测试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的应用中将引物和探针用于50μL的RPA反应体系，所述的正向引物的浓度为10μmol/L，反向引物的浓度为5μmol/L，所述的探针的浓度为10μmol/L、镁离子浓度280μmol/L，模板加样量为1μL；将2.1μL正向引物、2.1μL反向引物、0.6μL探针、1μL样品、12.2μL无DNase 和RNase 水和29.5μL缓冲液组成预混液，加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp nfo反应管中，然后将2.5μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上；将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下，充分混匀后37℃扩增20min，在反应第4min，将反应管取出充分混匀，之后放回反应装置中继续扩增，检测时加样量为5μL，试纸条显色时间控制在3 - 5min。