[发明专利]一种检测普氏立克次体的RPA方法、其专用引物和探针及用途

说明书

本发明提供了用于检测普氏立克次体的RPA检测方法，其专用引物、探针及其在普氏立克次体检测中的用途。所述检测方法、其专用引物和探针及基于普氏立克次体特异性保守序列设计的，具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列。本发明首次将新型恒温扩增技术RPA应用于普氏立克次体的检测中，该方法模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合，包括重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，对DNA模板进行扩增，可在37℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过侧向层析核酸试检测纸条实现可视化判别。本发明建立的检测方法灵敏度可达10拷贝数/μL，特异性高，对硬件设备的要求很低，且可在30min内完成检测，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测，适于推广应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及普氏立克次体的分子生物学，涉及一种检测普氏立克次体的方法及其用途，特别涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术（RPA技术）快速检测普氏立克次体的方法、其专用引物和探针及其用途。

背景技术

普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）俗称流行性斑疹伤寒，为专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，对外界环境抵抗力强、存活时间长，人类和动物普遍易感，且可通过气溶胶广泛传播，是高致死性、已生物战剂化的病原体之一。流行性斑疹伤寒为虱传播，临床症状较重，主要表现为高热、头痛、皮疹，甚者神经症状显著，可出现听觉障碍、神志昏迷直至死亡。

临床表现当人受到感染后，经10 - 14天的潜伏期，骤然发病，有剧烈头痛、周身痛和高热，4 - 7天后出现皮疹，严重的为出血性皮疹。有的还伴有神经系统、心血管系统等症状和其他实质器官损害。流行性斑疹伤寒，在人口密集和昆虫繁盛的环境内比较严重。当流行时，病人平均死亡率20%，严重时可达70%。病原体借人虱在人群中传染，所以灭虱是预防流行性斑疹伤寒的重要措施。对立氏立克次体的检测方法主要包括平板分离培养法、血清学技术、荧光定量PCR法。但是，这些方法存在成本较高、需要特定设备、耗时且需对样品进行复杂处理等缺陷，导致它们的实际应用范围严重受限。建立一种简单、快速、适合现场应用的立氏立克次体的检测方法有重要意义。

近几年来，恒温核酸扩增技术得到了快速发展，其中英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶恒温扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）被誉为是可替代PCR的核酸检测技术，其是基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟体内DNA复制的酶反应过程，依赖特定的酶和蛋白组合（重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶）对DNA模板进行扩增，可在25 - 43℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，且扩增产物可通过侧向层析检测试纸条实现可视化判别。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，特别适合用于体外诊断、食品安全、生物安全等领域。

发明内容

本发明一种检测普氏立克次体的RPA方法，所要解决的技术问题是提供一组用于快速检测普氏立克次体的特异性引物和探针，以及一种能快速、简便、特异的检测普氏立克次体的检测方法。