[发明专利]重组CHO细胞的贴壁微载体悬浮培养方法

权利要求书

1.一种重组CHO细胞的贴壁微载体悬浮培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)使用细胞生长液对重组CHO细胞进行传代培养，将传代培养后的重组CHO细胞，按照1～5×10⁵个细胞/mL的接种量接种至带有微载体的生物反应器；

(2)进行重组CHO细胞的扩增培养；

(3)当重组CHO细胞表达的目的蛋白含量≥0.5mg/L时，每天流加30％培养体积的细胞生长液；1周后，每天流加50％培养体积的细胞维持液；保持葡萄糖含量为0.7-1.2g/L；培养时间为25～30天；

其中，所述细胞生长液为含有10％～16％新生牛血清的DMEM培养基；所述细胞维持液为含有4％～8％新生牛血清的DMEM培养基；

在开始流加细胞维持液时，第1～4天流加的细胞维持液中新生牛血清含量分别为8％、5％、4％和4％；从第5天起，按照新生牛血清含量分别为5％、4％和4％的循环，流加细胞维持液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：复苏重组CHO细胞株，复苏后细胞存活率应不低于85％，24h后置换细胞生长液，然后放于37℃继续培养2-3天，待方瓶细胞成致密单层后，用胰蛋白酶消化传代，传代比例为1:3～1:4，2～3天换生长液一次；传代培养所得细胞经消化后可作为种子接种到生物反应器中，接种后细胞密度为1～5×10⁵个细胞/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体为：在温度37℃、气体压力10psi、pH 6.8-7.2、DO 50-60％条件下进行CHO细胞的扩增培养，培养过程中保持葡萄糖含量为2-3g/L。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)扩增培养开始时，转速为30rpm，3小时后转速调至50rpm，1天后调至70rpm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)流加细胞维持液后，调低培养温度为35℃，下调DO到40-50％，维持pH为7.0-7.4。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体为聚酯圆片。

7.根据权利要求1～3、6任一项所述的方法，其特征在于，所述重组CHO细胞为表达乙肝抗原的CHO细胞。