[发明专利]重组CHO细胞的贴壁微载体悬浮培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养领域，具体公开了一种重组CHO细胞的贴壁微载体悬浮培养方法，包括如下步骤：(1)使用细胞生长液对重组CHO细胞进行传代培养，将传代培养后的重组CHO细胞，按照1～5×10⁵个细胞/mL的接种量接种至带有微载体的生物反应器；(2)进行重组CHO细胞的扩增培养；(3)当重组CHO细胞表达的目的蛋白含量≥0.5mg/L时，每天流加细胞生长液；1周后，每天流加细胞维持液；培养时间为25～30天；其中，所述细胞生长液为含有10％～16％新生牛血清的DMEM培养基；所述细胞维持液为含有4％～8％新生牛血清的DMEM培养基。本发明采用贴壁微载体悬浮培养方法，并使用所述细胞生长液和细胞维持液对重组CHO细胞进行培养，表达目的蛋白，可显著提高目的蛋白的产量。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体地说，涉及重组CHO细胞的贴壁微载体悬浮培养方法。

背景技术

乙型肝炎病毒感染是一种严重威胁健康的全球性问题。乙型肝炎是由病毒引起的疾病，全球至少2亿人感染过乙肝病毒，其中3500万至4000万人为慢性乙肝病毒携带者。亚洲、非洲、部分的东欧和南欧是乙肝病毒的高发区，西欧、南美及大洋洲各国的乙肝感染率较低。我国是乙肝高发地区，约有1.2亿人携带乙肝病毒，其中25％的感染者为慢性乙型肝炎，每年大约有50万至70万人死于急性乙型肝炎引发的肝硬化和肝癌。

肝癌是世界上第五大常见的癌症，癌症致死率排在第三位。乙肝的治愈至今在全球仍然是一个难题，所以乙肝的预防则更为重要。通过接种乙肝疫苗，95％的儿童和成人得到了有效的保护。

目前国内外普遍使用酵母或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)生产乙型肝炎疫苗。CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。目前只有CHO表达乙肝疫苗已投入生产，这是除酵母乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。酵母表达乙肝疫苗由于生产工艺成熟简单(生物反应器悬浮培养)，使得酵母生产乙肝疫苗的成本比较低廉，所以目前市场上使用的乙肝疫苗大多数是酵母乙肝疫苗。但是酵母系统本身存在着许多缺陷，最重要的一点，酵母不能模拟蛋白在人体肝细胞中的翻译后修饰、蛋白折叠、大分子组装以及糖基化。这些特点正是抗原在动物细胞中引起免疫反应所必须的。而CHO细胞表达的乙肝抗原决定簇与人体来源的乙肝表面抗原高度相似。在免疫原性方面，CHO生产的乙肝疫苗的免疫原性与血源疫苗没有差异，明显优于酵母重组疫苗。调查显示，新生儿接种国产乙肝CHO疫苗第1年的抗HBs阳性率为98.25％，抗体GMT为77.64，而血源疫苗免疫后第1年抗HBs阳性率在73.3％～93.5％之间。与酵母重组疫苗比较，更低剂量的CHO乙肝重组疫苗在T细胞水平产生更高的免疫原性，这些疫苗刺激T细胞产生帮助引起更高的血清转化率和更高的抗HBs滴度。在安全性方面，根据现有的安全性记载，动物细胞表达的生物产品尤其CHO表达的产物的安全性很好，在已批准进入临床或生产的动物细胞表达的乙肝疫苗的使用中，没有发现严重的副反应。其中我国主导研发的CHO-C28细胞株，用于生产乙肝疫苗近30年，从未出现过安全事故。

由于传统的生产工艺是在有血清的情况下，采用大型转瓶贴壁培养重组CHO细胞，生产效率低(1-5mg·L^-1·d^-1)，较重组酵母表达的疫苗成本要高，所以占市场份额相对较小。目前已有很多公司和机构试图对培养表达HBsAg的重组CHO细胞进行无血清驯化，并进一步对其进行悬浮培养驯化，希望实现生物反应器高密度悬浮培养，来提高重组蛋白产量和降低生产成本。滕小锘等(表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞无血清培养基的优化及生物反应器培养，中国生物制品学杂志，2010年10月)在生物反应器培养过程中，灌注培养的重组CHO细胞表达的HBsAg产率为0.70mg·L^-1·d^-1，分批和流加培养时为0.30mg·L^-1·d^-1。但也许由于HBsAg本身的特性，针对表达乙型肝炎表面抗原的重组CHO细胞的悬浮优化或无血清优化，并无明显效果，仍低于传统生产工艺的产量。