[发明专利]一种同时检测多种肿瘤标志物的3D折叠纸基微流体荧光检测装置

权利要求书

1.一种同时检测多种肿瘤标志物的3D折叠纸基微流体荧光检测装置，其特征在于：包括以下步骤：

（1）纸基微流体芯片的制作；

在计算机上设计出3D纸基的图形，构成可折叠的三维亲水和疏水区域，用于同时检测多种肿瘤标志物，在纸基2、3两层增加检测区域孔的数目为2-5 ，即可增加同时检测的标志物种类数为 2-5，并用喷蜡打印机打印，放进烘箱烘烤一段时间，取出冷却至室温，将纸基沿着打印区域剪下，并进行三维折叠；

（2）纸基微流体芯片的预处理；

将烘烤好的纸基微流体芯片的第3层用等离子清洗机进行氧气等离子体处理，使纸表面的碳自由基形成氧自由基，导致醛基的产生，此目的是便于抗体在纸上的固定；

（3）三维纸基同时检测的免疫反应程序；

首先在等离子体处理过的纸基微流体芯片的第3层分别固定2-5种肿瘤标志物的包被抗体，然后用阻隔液阻隔纸上的结合位点，在纸基微流体芯片的第2层加入对应的2-5种肿瘤标志物的异硫氰酸荧光素标记抗体，将纸基微流体芯片的1、2两层对叠，在纸基微流体芯片的的第1层样品区加入待测抗原混合液，最后将三层全部对叠，进行免疫反应；

（4）荧光分析检测；

将纸基微流体芯片的第3层置于特定的激发光源下，根据可视化的荧光强弱评估2-5种肿瘤标志物浓度，将第3层的纸基微流体芯片用荧光分光光度计测定发射波长峰值，可精确得出检测的2-5种肿瘤标志物浓度。

2.根据权利要求1所述的同时检测多种肿瘤标志物的3D折叠纸基微流体荧光检测装置，其特征在于：在纸基2、3两层增加检测区域孔的数目为3，可同时检测的标志物种类数3种。

3.根据权利要求2所述的同时检测多种肿瘤标志物的3D折叠纸基微流体荧光检测装置，其特征在于：

(1)纸基微流体芯片的制作，使用的是规格为20cm×20cm的沃特曼1号色谱纸；

（2）纸基微流体芯片的预处理，将烘烤完成第3层纸基微流体芯片，放入等离子清洗机进行表面改性4min，利用氧气表面等离子体处理使纸的表面带上醛基便于抗体固定，在等离子体条件下，纸基纤维素上的碳自由基 - •CH-OH上的羟基会失去氢原子，从而形成氧自由基 - •O-CH2-，然后，该氧自由基上的单个电子与碳上的电子结合，导致醛基的产生；

（3）在荧光免疫反应程序中，首先在醛基改性过的纸基微流体芯片第3层G、H、I上分别固定4μL、40μg/mL的3种肿瘤标志物的包被抗体，J作为空白对照，在室温下反应30min后，用20μL、0.01molPH=7.4的磷酸缓冲液冲洗3次，然后再依次加入0.5%的BSA阻隔纸上未与抗体结合的特异性位点，室温下反应15min后用20μL、0.01molPH=7.4的磷酸缓冲液冲洗3次，在纸基微流体芯片第2层C、D、E上分别加入4μL、40μg/mL 对应的三种肿瘤标志物的异硫氰酸荧光素标记抗体，2min后将纸基微流体芯片的1、2两层对叠，在纸基微流体芯片第1层的A孔中加入20μL 的待测肿瘤标志物混合液，反应2min后将三层全部对叠，并在纸基微流体芯片第1层的A孔中加入40μL、0.01molPH=7.4的磷酸缓冲液将抗原与标记抗体复合物冲到3层；反应4min后用40μL、0.01molPH=7.4的磷酸缓冲液冲洗3次，并用吸收垫吸收废液；

（4）将纸基微流体芯片放到波长为470nm的激发光源下照射，可根据黄绿色荧光的强弱与比色卡进行比较视觉读出读数；将纸基微流体芯片放入样品板，用荧光分光光度计在波长为470nm的激发光下进行扫描，可根据荧光光谱的峰值精确地分别得出各种肿瘤标志物的浓度。