[发明专利]一种益生性牦牛源乳酸菌的分离、鉴定及初步筛选的方法在审
| 申请号： | 201710852452.6 | 申请日： | 2017-09-19 |
| 公开（公告）号： | CN108441434A | 公开（公告）日： | 2018-08-24 |
| 发明（设计）人： | 吴庆侠;董海龙;朱洪云;刘忠艳 | 申请（专利权）人： | 西藏农牧学院 |
| 主分类号： | C12N1/20 | 分类号： | C12N1/20;C12N1/02;C12Q1/689;C12Q1/04;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京中索知识产权代理有限公司 11640 | 代理人： | 宋涛 |
| 地址： | 西藏自治区林芝*** | 国省代码： | 西藏;54 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 厌氧培养 需氧 接种 单个菌落 乳酸菌 平板培养基 初步筛选 牦牛 蛋白胨缓冲液 生物技术领域 斜面培养基 冰箱保存 分离步骤 粪便样品 划线培养 无菌条件 菌悬液 上清液 灭菌 腹泻 冷藏 粪便 备用 | ||
1.一种益生性牦牛源乳酸菌的分离的方法，其特征在于：分离步骤为：取粪便样品中间部分约1g加入到装有已灭菌冷藏的蛋白胨缓冲液中，无菌条件下吸取1mL粪便上清液接种到装有MRS液体培养基中，37℃需氧及厌氧培养各24h，取200μl菌悬液进行MRS平板涂布，需氧及厌氧培养各24h，选取可疑单个菌落接种至相应平板培养基，划线培养后37℃需氧及厌氧培养各24h，再次选取单个菌落接种至相应平板培养基37℃需氧及厌氧培养，如此纯化2次后，选取单个菌落接种至相应斜面培养基，37℃需氧及厌氧培养各24h，4℃冰箱保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种益生性牦牛源乳酸菌的鉴定的方法，其特征在于：鉴定的步骤为：
(1)DNA提取；
①加异丙醇100ul混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000rpm/1min；
②倒掉底液，加500ul组织抑制剂Inhibitor Removal，然后离心倒掉底液；
③加洗液washing buffer500ul离心；
④预热双蒸水至37℃，然后将洗好的柱体下部分丢掉，换新的离心管加入双蒸水100ul溶解10分钟离心保留底液放-20℃保存；
(2)PCR扩增及测序方法；
16sRNA引物序列：
16S-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
16S-R：AAGGAGGTGATCCAGCC
(3)PCR切胶纯化根据试剂盒回收纯化。
3.根据权利要求2所述的一种益生性牦牛源乳酸菌的分离、鉴定及初步筛选的方法，其特征在于：步骤(2)中的PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s、55℃退火45s、72℃延伸1.2min，72℃延伸5min，共35个循环。
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