[发明专利]一种益生性牦牛源乳酸菌的分离、鉴定及初步筛选的方法

说明书

本发明属于生物技术领域且公开了一种益生性牦牛源乳酸菌的分离、鉴定及初步筛选的方法，分离步骤为：取粪便样品中间部分约1g加入到装有已灭菌冷藏的蛋白胨缓冲液中，无菌条件下吸取1mL粪便上清液接种到装有MRS液体培养基中，37℃需氧及厌氧培养各24h，取200μl菌悬液进行MRS平板涂布，需氧及厌氧培养各24h，选取可疑单个菌落接种至相应平板培养基，划线培养后37℃需氧及厌氧培养各24h，再次选取单个菌落接种至相应平板培养基37℃需氧及厌氧培养，如此纯化2次后，选取单个菌落接种至相应斜面培养基，37℃需氧及厌氧培养各24h，4℃冰箱保存备用。本发明起到保护肠黏膜的作用，从而减轻肠上皮的炎症和腹泻。

技术领域

本发明具体涉及一种益生性牦牛源乳酸菌的分离、鉴定及初步筛选的方法，属于生物技术领域。

背景技术

犊牦牛腹泻病一直是影响西藏牦牛养殖业的重要疾病，其原因复杂，多在冬、春交替的季节发生，在西藏各县均有，据调查，在班戈县，春天死亡的犊牦牛中腹泻致死的达到了70％。由于在该病治疗过程中抗生素的不合理使用，致使牦牛多种致病菌存在严重的多重耐药性。因此，迫切需要寻找有效而低风险的犊牦牛腹泻病治疗和预防方法。

益生菌是活的微生物，摄入足量对宿主健康有利。乳酸杆菌是常用的益生菌，可以增强肠粘膜的屏障功能，调节机体的免疫力，抑制病原菌。随着研究深入，越来越多的证据表明乳酸杆菌在治疗腹泻方面有重要的作用。研究发现，鼠李糖杆菌能够诱导SIgA的分泌，减缓大肠杆菌对小肠黏膜的黏附，进而起到保护肠黏膜的作用^[3]。 KOBAYASHI H^[4]等研究发现詹氏乳杆菌可以减少肠上皮细胞中趋化因子(CCL8,CXCL5,CXCL9,CXCL10,和CXCL11)的表达，从而减轻肠上皮的炎症和腹泻。

WEGMANN U和FRESE SA的研究证明细菌均具有宿主特异性，从某种动物分离的乳酸杆菌菌株对该种动物肠道具有强黏附力，对其它动物黏附力降低或无粘附力。再者，鉴于动物不同，其肠道微生物组成也不同，因此，分离自同种动物胃肠道的菌种是益生菌种的最佳来源^[7]。本试验拟从健康牦牛的粪便、肠道、肠内容物中分离可用于预防和治疗犊牦牛腹泻的乳酸菌。

发明内容

本发明要解决的技术问题克服现有的缺陷，提供一种益生性牦牛源乳酸菌的分离、鉴定及初步筛选的方法，可以增强肠粘膜的屏障功能，调节机体的免疫力，抑制病原菌，能够减缓大肠杆菌对小肠黏膜的黏附，进而起到保护肠黏膜的作用，从而减轻肠上皮的炎症和腹泻，可以有效解决背景技术中的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供一种益生性牦牛源乳酸菌的分离、鉴定及初步筛选的方法，分离步骤为：取粪便样品中间部分约1g加入到装有已灭菌冷藏的蛋白胨缓冲液中，无菌条件下吸取1mL粪便上清液接种到装有 MRS液体培养基中，37℃需氧及厌氧培养各24h，取200μl菌悬液进行MRS平板涂布，需氧及厌氧培养各24h，选取可疑单个菌落接种至相应平板培养基，划线培养后37℃需氧及厌氧培养各24h，再次选取单个菌落接种至相应平板培养基37℃需氧及厌氧培养，如此纯化2 次后，选取单个菌落接种至相应斜面培养基，37℃需氧及厌氧培养各24h，4℃冰箱保存备用。

优选的：鉴定的步骤为：(1)DNA提取；①加异丙醇100ul混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000rpm/1min；②倒掉底液，加500ul组织抑制剂Inhibitor Removal，然后离心倒掉底液；③加洗液washing buffer500ul离心；④预热双蒸水至37℃，然后将洗好的柱体下部分丢掉，换新的离心管加入双蒸水100ul溶解10 分钟离心保留底液放-20℃保存；

(2)PCR扩增及测序方法；

16sRNA引物序列：

16S-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG