[发明专利]鲜冬虫夏草在线提取高效液相特征图谱的构建方法及应用

权利要求书

1.一种鲜冬虫夏草在线提取高效液相特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取器的制备：

混合对照品提取器的制备：分别取对照品适量，精密称定，加入溶剂溶解，制成混合对照品溶液；精密量取混合对照品溶液，加入到已填充了硅藻土的预柱芯中，干燥，柱芯两端用微孔滤膜覆盖，安装于匹配的预柱套中，得到混合对照品的提取器；

供试品提取器的制备：取供试品适量，加入硅藻土充分研磨；精密称取混合均匀后的供试品和硅藻土，填充于空预柱芯，两端用微孔滤膜覆盖，安装于匹配的预柱套中，得到供试品的提取器；

(2)在线提取：将提取器接入高效液相色谱仪中的保护柱前，且置于柱温箱中；提取溶剂通过液相高压泵输送，在提取器中进行在线提取得到提取液；提取过程由自动进样器吸取水触发；其中所述柱温箱具有第一控温模块和第二控温模块；第一控温模块控制提取器的温度，第二控温模块控制保护柱和色谱柱的温度；

(3)高效液相色谱串联质谱检测：步骤(2)所得提取液进入保护柱，再经色谱柱进行高效液相色谱串联质谱检测；高效液相色谱色谱条件为：流速为1～2.5mL/min；流动相A为水，流动相B为0.1％乙酸-甲醇溶液；梯度洗脱为：0～3.5min：0％B；3.5～15.5min：0％B→30％B；15.5～25min：30％B；

(4)特征图谱的构建：根据混合对照品提取器在线检测结果，确定供试品提取器在线检测结果中色谱峰，将以下8个色谱峰建成特征图谱：

峰1为尿嘧啶，保留时间为2.76min，质谱数据为113[M+H]⁺m/z；

峰2为尿苷，保留时间为3.84min，质谱数据为245[M+H]⁺m/z；

峰3为肌苷，保留时间为8.66min，质谱数据为269[M+H]⁺m/z；

峰4为鸟嘌呤，保留时间为9.24min，质谱数据为152[M+H]⁺m/z；

峰5为鸟苷，保留时间为9.75min，质谱数据为284[M+H]⁺m/z；

峰6为腺嘌呤，保留时间为13.51min，质谱数据为136[M+H]⁺m/z；

峰7为腺苷，保留时间为15.30min，质谱数据为268[M+H]⁺m/z；

峰8为2’-脱氧腺苷，保留时间为17.55min，质谱数据为252[M+H]⁺m/z；

其中所述供试品为鲜冬虫夏草，精密称取混合均匀后的供试品和硅藻土的量为5～7mg；

其中所述第一控温模块控制提取器温度为70℃；提取溶剂为水，在线提取时间为3.5min；提取液经第二控温模块控制降温后，进入保护柱，再经色谱柱进行高效液相色谱串联质谱检测；提取过程由自动进样器吸取10μL水触发；

其中所使用的保护柱为：Agilent Zorbax SB-AQ，4.6mm×12.5mm，5μm，色谱柱为Agilent Zorbax SB-AQ，4.6mm×150mm，5μm，第二控温模块控温为20℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合对照品提取器的制备方法为：分别取对照品尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷、2’-脱氧腺苷适量，精密称定，按照重量体积比1:10～50mg/mL加入水溶解，制成混合对照品溶液浓度为20～100μg/mL；精密量取混合对照品溶液，加入到已填充了硅藻土的预柱芯中，干燥，柱芯两端用微孔滤膜覆盖，安装于匹配的预柱套中，得到装有混合对照品的提取器。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(3)中所述的流速为1.5mL/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其中高效液相色谱串联质谱检测的检测波长为260nm；检测器为二极管阵列检测器；质谱条件为：四级杆质谱，分流比2:1；正离子模式；选择性离子检测，m/z：112/胞嘧啶/[M+H]⁺、113/尿嘧啶/[M+H]⁺、127/胸腺嘧啶/[M+H]⁺、136/腺嘌呤/[M+H]⁺、137/次黄嘌呤/[M+H]⁺、152/鸟嘌呤/[M+H]⁺、243/胸苷/[M+H]⁺、244/胞苷/[M+H]⁺、245[M+H]⁺/尿苷/[M+H]⁺、268/腺苷/[M+H]⁺、269/肌苷/[M+H]⁺、284/鸟苷/[M+H]⁺、229/脱氧尿苷/[M+H]⁺、252/2′-脱氧腺苷/[M+H]⁺和268/脱氧鸟苷/[M+H]⁺；电喷雾离子源：干燥气：氮气，流速10L/min，干燥气温度350℃，雾化气压力35psi。