[发明专利]鲜冬虫夏草在线提取高效液相特征图谱的构建方法及应用

说明书

本发明属于色谱分析技术领域，具体公开了鲜冬虫夏草在线提取高效液相特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取器的制备；(2)在线提取；(3)高效液相色谱串联质谱检测；(4)特征图谱的构建。本发明所提供的在线提取‑高效液相色谱体系装置简单，操作简便，需要的样品量少，耗时少，极大地促进了该方法在实际生产中的应用，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及色谱分析技术领域，具体涉及一种鲜冬虫夏草在线提取高效液相特征图谱的构建方法及在中药材有效成分的在线提取分析中的应用。

背景技术

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.)寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。性味甘，平，归肺、肾经，具有补肾益肺，止血化痰疗效，用于治疗肾虚精亏，阳痿遗精，腰膝酸痛，久咳虚喘，劳嗽咯血等。现代研究表明冬虫夏草含有核苷、蛋白质、多糖、甾醇等活性物质，具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗衰老等活性。

冬虫夏草是一味珍稀中药材，近年来由于市场需求逐渐增大，而资源却十分匮乏，导致价格高昂，使得市场上掺杂品、混淆品、伪品增多。自2000年版《中国药典》起，腺苷作为冬虫夏草质量标准的含量测定指标被收载。研究表明，除腺苷外，尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、鸟嘌呤等其他核苷类成分也是冬虫夏草的指标性成分，且相比单一指标的含量测定，构建冬虫夏草核苷类成分的特征指纹图谱能更全面的体现药材的品质。

前期已有文献报道分析冬虫夏草核苷类成分所采用的样品制备方法多采用常规离线提取方法，如热回流提取法、索氏提取法、浸渍提取法、超声提取法等，这些方法不仅药材和溶剂消耗量大，而且提取时间长，操作步骤多。因此，建立快速便捷的样品制备方法有助于冬虫夏草核苷类成分的含量测定技术的提升。目前，已有在线液相色谱介质的预处理系统的相关研究，但存在一定程度的局限性，如专利《在线色谱分析的液相介质预处理装置》(专利号ZL 200720074371.X)提供的装置除了可以实现液相介质预处理外还可以达到流量大、防堵及基本消除气泡的目的，但是该装置并未将其与液相色谱仪真正连成一个在线分析系统，并不能真正意义上实现在线分析；另外，也有液相色谱在线脱盐、富集与质谱在线联用系统(专利号ZL 200610134981.4)以及固相萃取—液相色谱在线联用分析水中痕量有机物的方法(专利号ZL 200610023536.0)的相关报道。但是，这些研究都具有相应的局限性和不全面性。近几年，文献报告显示在线样品提取-高效液相分析技术相比传统的离线提取技术具有速度快，节省样本，自动化程度高等优势，已被成功应用于中药材的成分分析，但报道的文献方法一般需要在常规液相系统增加六通阀、加压装置、富集柱等装置，使得在实际生产应用存在一定困难。如专利《一种高效液相色谱在线分析方法及应用》(专利号ZL 201310107475.6)提供了一种高效液相在线分析方法，该系统包括样品预处理系统、高效液相色谱仪、可编辑逻辑控制器、触摸屏等装置，虽实现了样品含量及组分比例的在线检测，但是系统装置较多，操作较繁琐。

发明内容

为弥补现有技术的不足，满足现有的需求，本发明的目的是提供一种鲜冬虫夏草在线提取高效液相特征图谱的建立方法，该方法采用在线提取方式，所需样本量少，且整个高效液相系统分析过程只需要一个提取器连接高效液色谱仪即可完成样品的在线提取和分析检测，具有装置简单、操作简便和耗时少的优点。本发明是通过以下技术方案实现的：

一方面，一种鲜冬虫夏草的在线提取高效液相特征图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)提取器的制备：

混合对照品提取器的制备：分别取对照品适量，精密称定，加入溶剂溶解，制成混合对照品溶液；精密量取混合对照品溶液，加入到已填充了硅藻土的预柱芯中，干燥，柱芯两端用微孔滤膜覆盖，安装于匹配的预柱套中，得到混合对照品的提取器；