[发明专利]用于生产拉沙里菌素的工程菌及其制备方法与应用

权利要求书

1.制备用于生产拉沙里菌素的工程菌的方法，包括如下步骤：抑制链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172中LodE蛋白的表达和/或活性，从而获得所述用于生产拉沙里菌素的工程菌；所述LodE蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172中LodE蛋白的表达和/或活性是通过将所述链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172的基因组中所述LodE蛋白的编码基因替换为筛选标记基因实现的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述LodE蛋白的编码基因的序列为序列表中序列2。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述筛选标记基因为neo基因；所述neo基因的序列为序列表中序列1。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172的基因组中，所述LodE蛋白的编码基因是通过同源重组的方式被所述neo基因替换掉的，上游同源臂的序列如序列表中序列3所示，下游同源臂的序列如序列表中序列4所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：向链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172中导入重组载体，所述重组载体中含有自5’端到3’端依次相连的所述上游同源臂、所述neo基因和所述下游同源臂，所述上游同源臂和所述下游同源臂与所述链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172的基因组上的同源片段发生同源重组，即得所述用于生产拉沙里菌素的工程菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组载体为在pKC1139载体的酶切位点EcoRV处插入自5’端到3’端依次相连的所述上游同源臂、所述neo基因和所述下游同源臂后得到的重组质粒。

8.采用权利要求1-7中任一所述方法制备得到的用于生产拉沙里菌素的工程菌。

9.权利要求8所述工程菌在生产拉沙里菌素中的应用。

10.一种生产拉沙里菌素的方法，包括如下步骤：将权利要求8所述的工程菌进行发酵培养，从发酵产物中制得拉沙里菌素。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为28℃振荡培养10天。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述从发酵产物中制得拉沙里菌素是通过包括如下步骤的方法实现的：将所述发酵产物进行离心，分别收集菌体和上清液；所述菌体用无水乙醇进行萃取，得到萃取物1；所述上清液用乙酸乙酯进行萃取，得到萃取物2；所述萃取物1和所述萃取物2中均含有拉沙里菌素。