[发明专利]用于生产拉沙里菌素的工程菌及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种用于生产拉沙里菌素的工程菌及其制备方法与应用。本发明所提供的制备用于生产拉沙里菌素的工程菌的方法，包括如下步骤：抑制拉沙里菌素产生菌中LodE蛋白或其同源蛋白的表达和/或活性，从而获得所述用于生产拉沙里菌素的工程菌；所述LodE蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。本发明实现了阻断拉沙里菌素合成中负效基因表达的目的，使拉沙里菌素产量提升300％，摇瓶产量达到12mg/L。另外，首次构建了链霉菌FXJ1.172的遗传操作系统，成功实现通过基因工程的手段来获得拉沙里菌素高产突变株。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于生产拉沙里菌素的工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

放线菌是一类高G+C含量(69-78％)的革兰氏阳性细菌，其具有复杂的形态发育分化过程和丰富的次级代谢产物合成能力，广泛分布于土壤、海洋、植物等各种生境中。链霉菌是放线菌中的一大类进化较为高等的种系，具有繁多的次级代谢通路，是天然产物的主要来源。链霉菌产生的次级代谢产物占微生物活性天然产物总数的三分之一以上且具有广谱活性，如抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、抗肿瘤、免疫抑制剂等，被广泛应用于医学、农业和畜牧业等。据不完全统计，截止到2012年，临床上应用的抗生素有80％直接或间接来源于链霉菌。近年来大量研究表明，链霉菌中参与特定次级代谢产物合成的相关基因一般呈现出聚簇排列的规律，形成生物合成基因簇。这些基因通常包括调控基因、结构基因、后修饰基因以及抗性基因，对次级代谢产物的合成和产量发挥着至关重要的作用。

拉沙里菌素(lasalocid)是最早被报道的聚醚类离子载体之一。美国科学家Berger等人于1951年从拉沙里链霉菌(Streptomyces lasaliensis)的发酵产物中分离得到一种抗革兰氏阳性细菌的抗生素X-537A(即拉沙里菌素)。有别于其它常见聚醚类离子载体，拉沙里菌素不仅能够结合一价金属离子Na⁺和K⁺，还能选择性结合二价金属离子如Ca²⁺/Mg²⁺。1974年，拉沙里菌素产品在美国进行了实用性研究，结果表明其具有良好的抗球虫活性，且不易产生耐药性，满足国际安全性标准。如今，拉沙里菌素作为主要的抗球虫药物和促生长剂应用于家禽养殖和畜牧业已超过四十年，具有重要的经济价值；此外拉沙里菌素还被报道具有广谱活性，如抗寄生虫、抗病毒、抗细菌和抗真菌等，具有良好的的医药应用前景。

目前，国内外拉沙里菌素高产菌株的选育主要还是依赖于一些传统的物理和化学诱变手段，如紫外诱变和LiCl诱变等方法。传统方法尽管操作简单，但由于突变的不定向性及突变的累积使得菌株在获得高产的同时，在生理代谢和发育分化等方面会明显减弱，并且多次诱变往往导致较高的负突变率和抗性饱和，从而限制了菌株进一步改善的空间，且经多次诱变的生产菌株，其遗传稳定性较差，难以满足工业化稳定生产的需求。随着基因组学、代谢组学相关研究的不断深入，越来越多的次级代谢合成调控通路被解析，从分子生物学角度对合成通路进行调控、合成及后修饰的靶向改造，优化天然产物的合成路径，在工业菌株的改造中已得到逐步推广，为高效稳定的工业生产菌株的获取提供了新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生产拉沙里菌素的工程菌及其制备方法与应用。

本发明所提供的制备用于生产拉沙里菌素的工程菌的方法，其原理是将拉沙里菌素合成相关的负效基因进行阻断，解除其对拉沙里菌素生物合成的抑制作用，实现拉沙里菌素的高产。该方法具体可包括如下步骤：抑制拉沙里菌素产生菌中LodE蛋白或其同源蛋白的表达和/或活性，从而获得所述用于生产拉沙里菌素的工程菌；所述LodE蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。

其中，实现所述“抑制拉沙里菌素产生菌中LodE蛋白或其同源蛋白的表达和/或活性”的方法可为任何能够达到该目的的方法，包括基因编辑、代谢途径调控等手段。在本发明的一个实施例中，具体是通过将所述拉沙里菌素产生菌的基因组中所述LodE蛋白或其同源蛋白的编码基因替换为筛选标记基因来实现的。