[发明专利]一种伊维菌素偶联的Bt杀虫毒素及其应用

权利要求书

1. 一种伊维菌素偶联的Bt杀虫毒素，其特征在于：其制备方法的具体操作步骤如下：按1:1.5:1.5的摩尔比分别称取4’’-O- succinoyl伊维菌素、EDC和NHS，且溶于DMSO溶剂内，以对4’’-O- succinoyl伊维菌素的羧基进行活化，得活化后的4’’-O- succinoyl伊维菌素，待用；取Bt Cry2Ab杀虫蛋白配置含5 mmol /L Bt Cry2Ab杀虫蛋白的Na₂CO₃/ NaHCO₃缓冲液，即Bt Cry2Ab杀虫蛋白溶液，待用；分别量取配制好的活化后的4’’-O- succinoyl伊维菌素与所述Bt Cry2Ab杀虫蛋白溶液，搅拌1小时进行偶联反应，获得Bt杀虫毒素；所述4’’-O- succinoyl伊维菌素制备过程为：按摩尔比1:3:6称取伊维菌素、叔丁基二甲基氯硅烷和咪唑，并溶解于四氢呋喃，于室温下搅拌反应2小时，从而对伊维菌素的5-OH进行保护；取保护后的伊维菌素溶解于二氯甲烷中，并加入4-二甲氨基吡啶、三乙胺和琥珀酸酐，且保护后的伊维菌素、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、琥珀酸酐的摩尔比为1:4:8:16，之后避光水浴回流3小时，以对伊维菌素4’’-OH进行羧基化改造，接着用乙醚萃取产物，柱层析分离产物；然后取层析分离后的伊维菌素溶解于甲醇中，并加入对甲苯磺酸，且层析分离后的伊维菌素与对甲苯磺酸的摩尔比为1:6，室温搅拌反应30分钟进行脱保护，再采用乙酸乙酯萃取产物，最后薄层色谱分离即得4’’-O- succinoyl 伊维菌素。

2.根据权利要求1所述的一种伊维菌素偶联的Bt杀虫毒素，其特征在于：所述BtCry2Ab杀虫蛋白的制备步骤如下：

（1）将cry2Ab基因通过热击法转化至大肠杆菌工程菌以获得含有cry2Ab基因的大肠杆菌工程菌，之后将其接种至LB固体培养基上，将LB固体培养基置于30℃下恒温培养24h进行菌种活化；

（2）将活化后的大肠杆菌工程菌菌种接种于LB液体培养基中，并置于摇瓶中37℃发酵培养，转速设定为180 r/min，待菌液OD₆₀₀到达0.5后，将温度调整为25℃，180 r/min继续培养24h；接着将发酵培养所得发酵液置于4℃、10000 r/min 条件下离心 10min，离心结束后取沉淀重悬于Na₂CO₃ 裂解液，于4℃下超声裂解30 min，裂解后的溶液4℃、10000 r/min离心30 min，取上清液；

（3）将步骤（2）所得上清液过IDA-Ni亲和层析柱，并先采用Ni50缓冲液除去杂蛋白，后采用Ni500缓冲液洗脱目的蛋白；所述Ni50缓冲液的配方为NaCl 300mM、NaH₂PO₄ 50mM、咪唑50mM；Ni500缓冲液的配方为NaCl 300mM、 NaH₂PO₄ 50mM、咪唑 500mM；洗脱所得目的蛋白经脱盐柱PD-10脱盐则得到Bt Cry2Ab杀虫蛋白，将Bt Cry2Ab杀虫蛋白置于-20℃下保存，备用。

3.一种权利要求1所述伊维菌素偶联的Bt杀虫毒素的应用，其特征在于：所述Bt杀虫毒素作为农业杀虫剂的应用。