[发明专利]一种伊维菌素偶联的Bt杀虫毒素及其应用

说明书

本发明提供一种伊维菌素偶联的Bt杀虫毒素，其制备方法如下：称取4”‑O‑succinoyl伊维菌素、EDC和NHS，且溶于DMSO溶剂内，得活化后的4”‑O‑succinoyl伊维菌素，待用；取Bt Cry2Ab杀虫蛋白配置含5mmol/L BtCry2Ab杀虫蛋白的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液，即Bt Cry2Ab杀虫蛋白溶液，待用；分别量取配制好的活化后的4”‑O‑succinoyl伊维菌素与Bt Cry2Ab杀虫蛋白溶液进行偶联反应，获得Bt杀虫毒素。本发明Bt杀虫毒素具有较强的毒力，其对小菜蛾具有更好的杀虫效果，能够作为农业杀虫剂，即对防治农业害虫具有更好的应用前景。

【技术领域】

本发明属于农业害虫防治领域，具体涉及一种伊维菌素偶联的Bt杀虫毒素及其应用。

【背景技术】

近些年，农业科学的快速发展，农药防治起一定程度的促进作用。农药可以有效的防治农业病、虫、草、鼠等有害生物，保证了农业增产丰收这一重要环节。但病害抗药性的产生，是无论化学农药还是生物农药都不能避免的难题；害虫对农药抗药性就是克服农药位点作用，使之失效、钝化。在实际应用中，农药轮换施用、农药混配施用、增加农药对害虫的接触面积、培育害虫的敏感品系、增加生态多样性以增加害虫的多样性等等，实质上是使农药作用位点保持足够的敏感性，寻求克服抗性的手段。生物偶联是利用生物偶联技术将两种毒素偶联形成新的毒素，对保持农药位点的敏感性等具有重要的意义。

苏云金杆菌(Bacilus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上生产量最大、应用最为广泛的一类微生物杀虫剂，其晶体蛋白对570余种鳞翅目害虫及双翅目、膜翅目和鞘翅目等数十种害虫有杀虫毒力。一般认为，昆虫在取食晶体蛋白后，通过自身的中肠蛋白酶将其酶解为活性的毒素蛋白，毒素蛋白再和中肠上皮细胞刷状缘膜(BBMVs)上的受体结合，并进一步插入膜内，形成孔洞或离子通道，引起离子渗漏，破坏肠壁上皮细胞，使肠道内溶物渗入血腔，引起败血症，致使昆虫死亡；但昆虫的抗药性使得现有的Bt毒素的防效急剧下降，因此，对Bt毒素进行改造，提供一种具有较强毒力的Bt毒素是从业人员所迫切希望地。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种伊维菌素偶联的Bt杀虫毒素及其应用。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种伊维菌素偶联的Bt杀虫毒素，其制备方法的具体操作步骤如下：按1:1.5:1.5的摩尔比分别称取4”-O-succinoyl伊维菌素、EDC和NHS，且溶于DMSO溶剂内，以对4”-O-succinoyl伊维菌素的羧基进行活化，得活化后的4”-O-succinoyl伊维菌素，待用；取Bt Cry2Ab杀虫蛋白配置含5mmol/L Bt Cry2Ab杀虫蛋白的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲液，即Bt Cry2Ab杀虫蛋白溶液，待用；分别量取配制好的活化后的4”-O-succinoyl伊维菌素与所述Bt Cry2Ab杀虫蛋白溶液，搅拌1小时进行偶联反应，获得Bt杀虫毒素。

进一步地，所述Bt Cry2Ab杀虫蛋白的制备步骤如下：

(1)将cry2Ab基因通过热击法转化至大肠杆菌工程菌以获得含有cry2Ab基因的大肠杆菌工程菌，之后将其接种至LB固体培养基上，将LB固体培养基置于30℃下恒温培养24h进行菌种活化；

(2)将活化后的大肠杆菌工程菌菌种接种于LB液体培养基中，并置于摇瓶中37℃发酵培养，转速设定为180r/min，待菌液OD₆₀₀到达0.5后，将温度调整为25℃，180r/min继续培养24h；接着将发酵培养所得发酵液置于4℃、10000r/min条件下离心10min，离心结束后取沉淀重悬于Na₂CO₃裂解液，于4℃下超声裂解30min，裂解后的溶液4℃、10000r/min离心30min，取上清液；