[发明专利]一种针对电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试验

说明书

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域，具体是涉及一种针对电子烟烟雾的气溶胶水提物进行的细菌回复突变试验方法。

背景技术

现今，化学物质及其污染物对人体的潜在危害越来越受到社会的普遍关注与重视。B.N.Ames等于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)被世界各国及组织广为采用，是目前国际公认的检测新药、食品添加剂,食品包装材料及化妆品等的致突变性、致癌性的首选试验方法。国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用细菌回复突变试验(Ames试验)对卷烟烟气冷凝物潜在的致突变性进行检测。该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。

烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品，电子烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。电子烟制品其使用过程中通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的液体转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将汽化丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。使用过程中不产生烟气，其使用方式显著有别于传统卷烟，检测对象的改变导致样品前处理方法、检测剂量也有所不同，用于检测传统卷烟致突变性的细菌回复突变试验(Ames试验)已不能满足电子烟制品致突变性检测的需要，且目前国内外研究机构及烟草公司尚未制定电子烟气溶胶水提物细菌回复突变试验的标准方法。

电子烟制品通过电加热或者电子雾化方式使由烟碱、香味物质等组成的烟液转化为类似于卷烟烟雾的混合物，再将雾化后的丙三醇/尼古丁等混合“烟雾”传送至消费者，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。电子烟烟液经雾化后进入口腔和呼吸道，经由唾液及呼吸道粘液迁移作用于机体。而现有技术通常是直接对电子烟液本身进行分析测试，未考虑其抽吸时的形态、迁移等过程，导致分析测试的结果不能准确反应电子烟烟雾真实的遗传毒性。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种针对电子烟烟雾的气溶胶水提物进行的细菌回复突变试验方法，以满足电子烟制品致突变性检测的需要，增强检测结果的准确性，进而更为有效地评价电子烟制品的安全性。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

一种针对电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试验，具体为以下步骤：

(1)样品前处理：

采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，-80℃保存待用；

(2)受试菌的培养：

将TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌分别加入到装有培养基的无菌三角瓶中，置于37℃条件下，静置培养16h或100次/min振荡培养10h；

(3)受试菌浓度的确定：

用紫外分光光度计分别测定培养所得TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌在600nm下的OD值，然后用培养基稀释菌液至其OD₆₀₀值为0.5；

(4)S9混合液的配制：

将1.65mol/L的氯化钾溶液和0.4mol/L的氯化镁溶液按照1:1的体积比混合后配制成氯化钾-氯化镁溶液；取磷酸缓冲液、氯化钾-氯化镁溶液、0.05mol/L的葡萄糖-6磷酸钠盐缓冲液和0.025mol/L的辅酶-Ⅱ溶液，按照30:2:5:8的体积比混合，用0.22μm无菌过滤器过滤除菌后，与S9代谢活化液按照9:1的体积比混合，配制成S9混合液备用；

(5)受试物的分组

将受试物分为四组：自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组和样品测试组；其中，样品测试组按表1所示的不同剂量将待测液加入培养中；自发回变组、溶剂对照组和阳性对照组则按表2所示的不同剂量将待测液加入培养中；将自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组、样品测试组样品分别按表3所示的4个检测体系加样；

表1Ames细菌回复突变试验样品测试组加样表