[发明专利]血清中25‑羟基维生素D2/D3双流路平行液相色谱质谱联用含量检测方法

权利要求书

1.血清中25-羟基维生素D₂/D₃含量检测方法，其特征在于，包括步骤：

(1)样品前处理：向加入内标工作液的血清样品中依次加入饱和硫酸锌溶液和乙腈，震荡，静置，加入正己烷，震荡，离心，取上层有机层，吹干，复溶配成甲醇溶液；

(2)利用液相色谱串联质谱法进行分析检测，其中，液相色谱采用第一平行液相和第二平行液相进行双样品交替分析，任一平行液相分析的同时另一平行液相洗平衡，任一平行液相完成数据采集时，另一平行液相立即开始采集数据，以实现连续数据采集，流动相包括A相和B相，A相为质量浓度0.1％的甲酸水溶液，B相为含质量浓度0.1％的甲酸和2mmol/L乙酸铵的甲醇溶液；分析和洗平衡的梯度洗脱时间程序分别如表1和表2所示。

表1.分析的梯度洗脱时间程序

表2.洗平衡的梯度洗脱时间程序

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：取100μL血清样品于1.5mL离心管中，加入10μL内标工作液，充分混匀；再加入饱和硫酸锌溶液100μL；加入200μL乙腈；剧烈震荡30秒，室温静置15分钟；加入1mL正己烷，剧烈震荡30秒，14000g以上离心5分钟；取最上层有机层600μL，室温下氮气吹干，加入75％甲醇溶液200μL，充分混匀30秒。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述内标工作液的配制方法如下：用甲醇配制浓度为1000μg/mL的D6-25-OHD₂和D6-25-OHD₃的混合内标储备液，再用甲醇稀释为浓度为25ng/mL的内标工作液。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中的液相色谱采用岛津Nexera MX系统。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中的质谱采用三重四极杆质谱仪。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中的液相色谱条件如下：

色谱柱：Shim-packXR-C8

流速：0.4mL/min

柱温：25℃

进样量：20μL

自动进样器温度：4℃

阀切换时间：0.15min.。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中的质谱条件如下：

表3.MRM参数